Molecular Characterization of B-Acute Lymphoblastic Leukemia (B-ALL): Genomic and functional analysis of Acute Lymphoblastic Leukemia and an in vitro model of targeted genetic modification

Abstract

[ES] Introducción: Los pacientes con leucemia aguda linfoblástica se caracterizan por la presencia de una serie de alteraciones genéticas que marcan el curso de la enfermedad. Estas alteraciones son la base de los actuales sistemas de clasificación y algunas de ellas han sido establecidas como importantes marcadores pronósticos. Además, el reciente desarrollo de las técnicas ómicas, como la secuenciación masiva y los ensayos de arrays, han posibilitado el estudio de un gran número de alteraciones genéticas recurrentes que podrían establecerse como nuevos marcadores de pronóstico, ayudando en la clasificación y estratificación del riesgo de los pacientes y en la identificación de predictores de la respuesta al tratamiento. A pesar de las altas tasas de supervivencia de estos enfermos, especialmente en la población pediátrica, un alto porcentaje de los pacientes siguen presentando recaídas, suponiendo así uno de los principales problemas en la clínica de la enfermedad, junto con la toxicidad al tratamiento. La recaída de la LAL-B se caracteriza por una gran heterogeneidad clonal, compuesta por un amplio número de alteraciones que podrían estar impulsando la evolución de la enfermedad. Aunque las recaídas se dan principalmente en los adultos, se ha reportado un alto porcentaje de niños, portadores del gen de fusión ETV6/RUNX1 que presentan recaídas tardías. Esta alteración es la traslación más frecuente de la infancia y aunque su papel en el desarrollo de la enfermedad parece estar claro, existe controversia acerca de la importancia de este en el mantenimiento del fenotipo leucémico. Mediante el desarrollo de esta tesis doctoral se emplea la combinación de las nuevas tecnologías ómicas y del sistema de edición genética CRISPR/cas9, con el objetivo de alcanzar una mayor comprensión de las anomalías genéticas de la LAL-B tanto en el diagnóstico como en la recaída. Además, el uso del sistema CRISPR/Cas9 proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares de las translocaciones involucradas en LAL-B, abriendo nuevas vías para el manejo de la enfermedad. Objetivos: I) Diseñar y validar un panel de NGS personalizado para la detección de las principales alteraciones moleculares asociadas con el riesgo genético de la LAL-B en el diagnóstico. II. Estudiar el perfil genético relacionado con la recaída de los pacientes de LAL-B a través del estudio integrativo de mutaciones y CNVs mediante el uso combinado de la NGS, MLPA y aCGH. III. Evaluar el papel del gen de fusión ETV6/RUNX1 en el mantenimiento del fenotipo leucémico mediante la generación de un modelo in vitro y un modelo de xenoinjerto. Los resultados de esta tesis se dividen en tres artículo publicados en revistas científicas, de acuerdo con los objetivos planteados: Artículo I: Montaño A. et al. J. Pers. Med. 2020, 10, 0137; doi:10.3390/jpm10030137. Artículo II: Forero-Castro M. & Montaño A. et al. Diagnostics 2020, 10(7), 455. doi:10.3390/diagnostics10070455. Artículo III: Montaño A. et al. Cells 2020, 9(1), 215. doi: 10.3390/cells9010215. Principales conclusiones: I) l uso de este panel personalizado de NGS permite detectar de forma rápida y eficaz las principales alteraciones genéticas presentes en LAL-B en un solo experimento (mutaciones, CNVs, aneuploidías y translocaciones). La aplicación del panel nos permitiría así acelerar el proceso de diagnóstico molecular de los pacientes, ayudando en la clasificación y estratificación de los enfermos, así como en la toma de decisiones terapéuticas. II) El presente estudio proporciona pruebas adicionales de que la clonalidad de la LAL-B es genéticamente dinámica desde el diagnóstico hasta la recaída. La combinación de análisis de NGS, aCGH y MLPA permitió además una mejor caracterización molecular del perfil genético en los pacientes con LAL-B en recaída. III) La eliminación del gen de fusión E/R reduce significativamente el potencial oncogénico de las células leucémicas (REH, E/R positivas) tanto in vivo como in vitro. Las células E/R KO también mostraron una mayor sensibilidad a los fármacos (copanlisib solo y en combinación con prednisolona), lo que sugiere que la expresión E/R podría estar implicada en la resistencia a la prednisolona observada en algunos pacientes. Estos resultados sugieren que el gen de fusión E/R juega un papel importante en el mantenimiento del fenotipo leucémico. Por consiguiente, el gen de fusión podría convertirse en una posible diana terapéutica específica para estos pacientes con la que se obtendrían mejores tasas de respuesta.