Investigación del splicing del pre-ARNm en el mieloma múltiple: desde su función en la patogenia a su abordaje terapeútico

Abstract

[ES]El origen del cáncer se ha relacionado tradicionalmente con modificaciones que se producen en la secuencia del ADN de los genomas de las células cancerosas. Sin embargo, la mayoría de los cambios en la expresión de los genes no está aparentemente precedida por una alteración del ADN en forma de mutaciones, anomalías cromosómicas o incluso eventos epigenéticos. En los últimos 30 años el estudio de la expresión génica a escala global se ha utilizado extensamente para caracterizar todo tipo de neoplasias. El desarrollo de los microarrays de expresión y más recientemente de la RNA-Seq ha sido clave para disponer de una información detallada de los patrones de expresión génica de los diferentes tumores. En algunas neoplasias, el estudio del perfil de expresión génica ha permitido la identificación de subtipos, ha ayudado a mejorar la estratificación de los pacientes e incluso ha contribuido a llevar a cabo tratamientos más personalizados o dirigidos. No obstante, la mayoría de estos estudios se han centrado en investigar la expresión génica del transcrito canónico, sin tener en cuenta la expresión del resto de los transcritos o isoformas que pueden obtenerse como resultado del splicing o procesamiento del pre-ARNm a partir de un mismo gen. En este sentido, actualmente es bien conocido que las diferentes isoformas pueden expresarse de forma desigual a la isoforma canónica y desempeñar funciones distintas, incluso divergentes, interviniendo de forma muy diferente en la patogenia tumoral. De hecho, el splicing del pre-ARNm es uno de los mecanismos celulares de regulación postranscripcional más importantes. Puesto que la mayoría de los genes pueden dar lugar a múltiples transcritos una consecuencia de este procesamiento es a veces, incluso, la producción de proteínas con funciones opuestas. Este fenómeno está bien ilustrado en el hecho de que varios de los genes que codifican proteínas implicadas en rutas apoptóticas son capaces de dar lugar a isoformas pro y anti apoptóticas mediante este proceso. La expresión génica se ha analizado minuciosamente en el MM. Los primeros estudios ya mostraron que los perfiles de expresión génica de las CPs tumorales eran claramente diferentes a los de las CPs normales de donantes sanos, y que dentro del grupo de los mielomas se podían encontrar subgrupos moleculares más parecidos a las GMSI, y otros similares a las líneas celulares de MM302. Posteriormente, se elaboró una clasificación molecular del MM basada en los perfiles de expresión génica que identificaba siete subgrupos distintos52. Estas subentidades moleculares con algunas modificaciones se han confirmado en numerosos estudios posteriores, no solo utilizando microarrays de expresión sino también mediante RNA-Seq. En las neoplasias de CPs, al igual que sucede en otros cánceres, la investigación del splicing del pre-ARNm y de la variedad de isoformas generadas mediante este mecanismo, ha sido muy limitada, tanto a nivel del transcriptoma completo como enfocándose en genes particulares. Por este motivo, hemos pensado que resultaría interesante avanzar en el estudio de cómo este mecanismo de regulación postranscripcional puede influir en la patogenia del MM y otras discrasias de células plasmáticas, e incluso averiguar si la modulación farmacológica del spliceosoma podría servir como abordaje terapéutico. Hasta ahora no se ha descrito ninguna alteración cromosómica ni mutación o desregulación significativa de un gen o ruta molecular particular que esté presente en la LCPp, la forma más agresiva de las neoplasias de CPs, y no lo esté en el MM. Esto indica que otros procesos biológicos pueden ser los responsables de la trasformación de la célula plasmática en una célula tumoral mucho más agresiva e incontrolable que la del MM. La búsqueda de diferencias, tanto en el patrón de splicing como en la expresión de las distintas isoformas, entre el MM y la LCPp podría ayudarnos a identificar posibles mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de la LCPp, y que no sean dependientes de la presencia de las alteraciones genéticas ya conocidas. TP53 es un conocido gen supresor tumoral que ha sido ampliamente estudiado. Concretamente el splicing del pre-ARNm es uno de los mecanismos postranscripcionales que ha emergido en los últimos años como uno de los procesos más relevantes en la regulación de p53. Se han descrito al menos 12 isoformas proteicas codificadas a partir de 9 ARNm (TAp53α, TAp53β, TAp53γ, Δ40p53α, Δ40p53β, Δ40p53γ, Δ133p53α, Δ133p53β, Δ133p53γ, Δ160p53α, Δ160p53β y Δ160p53γ). Algunas de las isoformas difieren entre sí en los dominios de transactivación y en el dominio C-terminal, lo que les permite regular diferencialmente la expresión de diferentes genes dianas y ser reguladas también de forma variable por los reguladores de p53. Varios trabajos han demostrado que la alteración de los niveles de expresión de las isoformas de p53 puede inhibir o potenciar su propia actividad como supresor tumoral en diferentes neoplasias y por tanto, influir en su respuesta al tratamiento y pronóstico. La expresión de las isoformas de p53 no se ha investigado aún en el MM. Por este motivo, el análisis de las isoformas de p53, tanto a nivel de proteína como de ARNm, en muestras de pacientes con MM tratados homogéneamente en el marco de un ensayo clínico, podría proporcionar información novedosa de su valor pronóstico. Actualmente se están desarrollando estrategias terapéuticas dirigidas a modular la maquinaria del splicing con resultados esperanzadores. De hecho, existen una serie de fármacos que modifican los patrones de splicing del pre-ARNm, cuyo mecanismo de acción es bastante desconocido. Algunos de ellos se están investigando como drogas antitumorales en ensayos clínicos. En este sentido, se cree que la investigación del efecto de estos agentes en las células mielomatosas sería útil para ampliar el espectro de fármacos con potencial utilidad en el MM y además, para descifrar los mecanismos moleculares del proceso de splicing y de su regulación en el MM. Los objetivos que se plantean a la hora de abordar este trabajo son: Objetivo 1: Analizar el transcriptoma de casos de LCPp y de MM que comparten un fondo genético similar y compararlos entre sí. • Analizar el perfil de expresión génica de muestras de LCPp y compararlo con el de las muestras de MM. • Explorar los eventos de splicing alternativo en las LCPp en relación a los observados en el MM. • Identificar las isoformas de ARNm diferencialmente expresadas entre la LCPp y el MM. • Analizar la existencia de sitios reguladores de splicing alternativo en ambas neoplasias de CPs mediante análisis bioinformáticos. Objetivo 2: Evaluar la expresión de las isoformas de p53 en pacientes con MM. • Identificar y cuantificar las isoformas proteicas de p53 en pacientes con MM. • Analizar el efecto de la expresión de las isoformas proteicas de p53 en el pronóstico de los pacientes. • Examinar los patrones de expresión de las isoformas de p53 a nivel de ARNm y compararlo con lo observado a nivel de proteínas. Objetivo 3: Investigar si la modulación farmacológica del spliceosoma, mediante la amilorida, puede servir como abordaje terapéutico en el MM. • Analizar el efecto citotóxico in vitro e in vivo de la amilorida en el MM. • Estudiar el mecanismo de acción de la amilorida en las células del MM.