Desarrollo de métodos rápidos de análisis basados en espectrometría de masas con ionización por electrospray para la determinación de compuestos de interés clínico en matrices biológicas

Abstract

[ES] Esta Tesis Doctoral está enfocada al desarrollo de métodos analíticos rápidos basados en espectrometría de masas (MS, Mass Spectrometry) con ionización por electrospray (ESI, ElectroSpray Ionization) para la determinación de compuestos de interés clínico en matrices biológicas. En los últimos años ha habido un gran interés en el desarrollo de este tipo de metodologías que permiten la determinación simultánea de un gran número de compuestos en tiempos de análisis cortos. Estas estrategias rápidas pueden utilizarse en el ámbito clínico como etapa de cribado para obtener información clínica relevante mediante el análisis de diversos biomarcadores presentes en muestras biológicas en un corto periodo de tiempo. Posteriormente, solo para aquellos casos en que se presenten compuestos con valores anómalos, se requeriría una etapa de confirmación con otras metodologías de mayor complejidad, que impliquen mayores tiempos de análisis. Debido a la necesidad de obtener resultados fiables, la espectrometría de masas es la técnica más adecuada, por su elevada sensibilidad, selectividad y capacidad de identificación. En esta Tesis Doctoral se utilizan dos analizadores de masas diferentes: un analizador de triple cuadrupolo (QqQ, triple quadrupole) y un analizador de masas Orbitrap. Esta memoria se ha estructurado en dos partes diferencias en función de la metodología rápida desarrollada. En la primera parte de la Tesis se propone una estrategia basada en la introducción directa de la muestra en el espectrómetro de masas, como etapa de cribado, con la posibilidad de llevar a cabo, en la misma configuración instrumental, el análisis confirmatorio utilizando una técnica de separación. Para ello, se utiliza un cromatógrafo de líquidos acoplado a un espectrómetro de masas donde se mantiene la columna cromatográfica en el sistema. La utilización de una fase móvil con un alto poder de elución elimina la capacidad separativa de la columna, permitiendo la introducción directa de la muestra en el equipo de MS. Con un cambio en la composición de la fase móvil es posible la separación cromatográfica de los compuestos. En la segunda parte de la Tesis se proponen diversas metodologías basadas en el acoplamiento de precolumnas de protección (gC, guard column) a un espectrómetro de masas. La inclusión de estas precolumnas permite solucionar problemas de sensibilidad y morfología de pico deficiente que se observan para algunos compuestos con las metodologías no separativas. Estas mejoras se consiguen sin un incremento significativo del tiempo de análisis, que se mantienen entre 1 y 3 min. Para confirmar los resultados obtenidos con los métodos rápidos desarrollados, en esta Tesis también se han propuesto métodos basados en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) adecuados para cada grupo de compuestos. Las metodologías desarrolladas han sido aplicadas a la determinación y cuantificación de compuestos de interés clínico, como son las poliaminas y los aminoácidos, en muestras de saliva y orina. Estos compuestos están implicados en una gran diversidad de procesos biológicos y se ha asociado la alteración de su concentración en distintas muestras biológicas con diferentes patologías. Considerando su importancia clínica, es de gran interés el desarrollo de métodos que permitan su determinación fiable en un periodo corto de tiempo. Estos métodos podrían utilizarse para el diagnóstico temprano de diferentes enfermedades. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es la puesta a punto de metodologías analíticas rápidas basadas en espectrometría de masas con una fuente de ionización por electrospray orientadas a la determinación y cuantificación de compuestos de interés clínico en muestras biológicas no invasivas. La espectrometría de masas permite simplificar de forma significativa los procedimientos analíticos debido a la enorme cantidad de datos que proporciona, consiguiendo en muchos casos la obtención de información cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa para resolver el problema analítico planteado. La hipótesis de partida es la viabilidad de utilizar la introducción directa de la muestra a un espectrómetro de masas con una fuente de ionización por electrospray en la modalidad análisis por inyección en flujo (FIA-MS, Flow Injection Analysis-Mass Spectrometry), o bien utilizando precolumnas de protección como etapa de limpieza y fraccionamiento previo a la detección por espectrometría de masas para la determinación de forma rápida de poliaminas y aminoácidos en muestras de orina y saliva.