Compartir
Título
Implicación de la expresión condicional de HGAL en modelos murinos de linfoma de células grandes B difuso
Autor(es)
Director(es)
Materia
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Linfoma de células B
Mutaciones somáticas
ensayo clínico
detección precoz del cáncer
Clasificación UNESCO
6310.03 Enfermedad
2415 Biología Molecular
Fecha de publicación
2023
Resumen
[ES] Los linfomas de células grandes B difusos (LCGBD) son tumores clínica y
genéticamente heterogéneos. La desregulación de diversos procesos biológicos
específicos de las células B, como la señalización del receptor de células B (BCR) y la
regulación de la motilidad, contribuyen a la linfomagénesis. La proteína HGAL (del
inglés human germinal associated lymphoma) es una proteína adaptadora específica de
las células B que controla su motilidad y la señalización del BCR. En las células B
normales, el gen HGAL se expresa en el centro germinal y rápidamente es reprimido. La
mayoría de los LCGBD, principalmente los del centro germinal (GCB), aunque en menor
medida los de tipo activado (ABC), expresan HGAL.
Para investigar las consecuencias de la expresión constitutiva de HGAL in vivo,
generamos ratones que expresaban condicionalmente HGAL humano en diferentes etapas
del desarrollo hematopoyético usando 3 enfoques restringidos mediados por la
recombinasa Cre para iniciar la expresión de HGAL en las células madre
hematopoyéticas, las células pro-B o las células B del centro germinal. Tras la
estimulación inmunológica, se observaron centros germinales más grandes en ratones en
los que se inició la expresión de HGAL en células B del centro germinal, lo que puso de
evidencia su implicación en el proceso tumorogénico: en el examen macroscópico estos
animales presentaban una marcada esplenomegalia causada por grandes tumores,
independientemente del promotor que controla la expresión de HGAL. Los tres modelos
de ratón desarrollaron LCGBD con una frecuencia del 12% al 30% a partir de los 13
meses, lo que condicionó una supervivencia más corta: 21 meses, 20 meses y 16 meses
de supervivencia específica media las cohortes de Rosa26HGAL/Aid-Cre,
Rosa26HGAL/Mb1-Cre y Rosa26HGAL/Sca1-Cre, respectivamente. Los estudios
inmunohistoquímicos revelaron que todos los linfomas eran del tipo BGC, con
infiltración nodular difusa de los órganos afectados por grandes células linfoides
pleomórficas que expresaban B220, PAX5, HGAL, PNA e IRF4.
Además, en estos modelos murinos la sobreexpresión condicionada de HGAL dio
lugar a una evidente afectación extraganglionar con afectación del hígado y de los
ganglios linfáticos en los ratones Rosa26HGAL/Sca1-Cre, del riñón y del páncreas en los
ratones Rosa26HGAL/Mb1-Cre y del riñón y del hígado en los ratones Rosa26HGAL/Aid-
Cre. El estudio de microarrays puso de manifiesto la presencia de una marcada expresión
diferencial entre las células con linfoma y los esplenocitos B normales en la que destacaba
una sobreexpresión del regulador de la señalización de proteína G1 (RGS1), relacionado
con la regulación de la migración celular y de RAB10. El análisis de los genes expresados
diferencialmente entre las células esplénicas B de los tres modelos murinos en
comparación con ratones control de la misma camada reveló un enriquecimiento en genes
comunes a los tres modelos entre los que destacaba una sobreexpresión en los linfomas
de la señalización de mTORC1, la respuesta de interferón, las dianas E2F y la
señalización de la vía IL-6/JAK/STAT3.
La secuenciación del exoma completo de 8 muestras de tumores murinos reveló
la presencia de 124 mutaciones sin-sentido o de sentido erróneo en 110 genes, con una
media de 15 por tumor (número similar a la mediana de 17 alteraciones genéticas por
tumor encontradas en los LCGBD humanos). Algunos de los genes mutados ya habían
sido descritos previamente en tumores humanos del tipo LCGBD, con 18 mutaciones
detectadas previamente, de forma recurrente, en un 0.7% de los LCGBD humanos : PIM1,
GNA13, FAS, PDF4DIP, NFKBIA y PTPN6. Posteriormente, la secuenciación del ARN
mostró que todos los tumores murinos analizados expresaban BCL6. Es posible que la
ausencia de expresión de BCL6 en algunos tumores con expresión de HGAL pudiera
deberse a la estimulación mejorada del BCR con HGAL en estos tumores, tal y como se
ha descrito en algunos estudios que muestran una disminución en la expresión de proteína
proteica de BCL6. El análisis del reordenamiento de las inmunoglobulinas confirmó que
todos los tumores de células B eran clonales y tenían mutaciones somáticas
independientemente del impulsor del promotor encargado de la expresión de HGAL.
Nuestros resultados demuestran que la expresión forzada constitutiva de HGAL conduce
al desarrollo de LCGBD de tipo BCG.
[EN] Diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL) are clinically and genetically
heterogeneous tumors. Dysregulation of various biological processes specific to B cells,
such as B cell receptor (BCR) signaling and regulation of motility, contribute to
lymphomagenesis. Human germinal associated lymphoma (HGAL) protein is a specific
adapter protein of B cells that controls their motility and BCR signaling. In normal B
cells, the HGAL gene is expressed in the germinal center and is rapidly repressed. Most
DLBCL, mainly those of the germinal center (GCB), although to a lesser extent those of
the activated type (ABC), express HGAL.
To investigate the consequences of constitutive expression of HGAL in vivo,
we generated mice conditionally expressing human HGAL at different stages of
hematopoietic development using 3-restricted Cre recombinase-mediated approaches to
initiate HGAL expression in hematopoietic stem cells, pro-B or B cells of the germinal
center. After immunological stimulation, larger germinal centers were observed in mice
in which the expression of HGAL was initiated in B cells of the germinal center, which
evidenced its involvement in the tumorigenic process: in the macroscopic examination
these animals presented a marked splenomegaly caused by large tumors, regardless of the
promoter that controls HGAL expression. The three mouse models developed DLBCL
with a frequency of 12% to 30% from 13 months, leading to a shorter survival: 21 months,
20 months and 16 months of median specific survival in the Rosa26HGAL/Aid-Cre,
Rosa26HGAL/Mb1-Cre and Rosa26HGAL/Sca1-Cre cohorts, respectively.
Immunohistochemical studies revealed that all the lymphomas were of the SLNB type,
with diffuse nodular infiltration of the affected organs by large pleomorphic lymphoid
cells expressing B220, PAX5, ALGH, PNA, and IRF4.
In addition, in these mouse models conditioned overexpression of HGAL resulted
in evident extranodal involvement with involvement of the liver and lymph nodes in
Rosa26HGAL/Sca1-Cre mice, kidney and pancreas in Rosa26HGAL/Mb1-Cre mice and
kidney and liver in Rosa26HGAL/Aid-Cre mice.
The microarray study revealed the presence of a marked differential expression
between cells with lymphoma and normal B splenocytes, in which an overexpression of
the regulator of signaling protein G1 (RGS1), related to the regulation of cell migration
and RAB10. Analysis of differentially expressed genes between spleen B cells of the three
mouse models compared with littermate control mice revealed an enrichment in genes
common to all three models notable among them was an overexpression of B signaling
in lymphomas of mTORC1, interferon response, E2F targets, and IL-6/JAK/STAT3
signaling pathway.
Whole-exome sequencing of 8 murine tumor samples revealed the presence of
124 nonsense or missense mutations in 110 genes, with a mean of 15 per tumor (like the
median of 17 genetic alterations per tumor found in the human DLBCL). Some of the
mutated genes had already been previously described in human LCGBD-type tumors,
with 18 mutations previously detected, recurrently, in 0.7% of human DLBCL: PIM1,
GNA13, FAS, PDF4DIP, NFKBIA, and PTPN6. Subsequently, RNA sequencing showed
that all murine tumors analyzed expressed BCL6. It is possible that the absence of BCL6
expression in some tumors with HGAL expression could be due to the enhanced
stimulation of the BCR with HGAL in these tumors, as has been described in some studies
showing a decrease in the expression of HGAL protein. Immunoglobulin rearrangement
analysis confirmed that all B-cell tumors were clonal and had somatic mutations,
regardless of the promoter drive responsible for HGAL expression. Our results
demonstrate that constitutive forced expression of HGAL leads to the development of
GCB-DLBCL.
Our results demonstrate that constitutive forced expression of HGAL leads to the
development of DLBCL.
URI
DOI
10.14201/gredos.152948
Colecciones