Implicación de la expresión condicional de HGAL en modelos murinos de linfoma de células grandes B difuso

Abstract

[ES] Los linfomas de células grandes B difusos (LCGBD) son tumores clínica y genéticamente heterogéneos. La desregulación de diversos procesos biológicos específicos de las células B, como la señalización del receptor de células B (BCR) y la regulación de la motilidad, contribuyen a la linfomagénesis. La proteína HGAL (del inglés human germinal associated lymphoma) es una proteína adaptadora específica de las células B que controla su motilidad y la señalización del BCR. En las células B normales, el gen HGAL se expresa en el centro germinal y rápidamente es reprimido. La mayoría de los LCGBD, principalmente los del centro germinal (GCB), aunque en menor medida los de tipo activado (ABC), expresan HGAL. Para investigar las consecuencias de la expresión constitutiva de HGAL in vivo, generamos ratones que expresaban condicionalmente HGAL humano en diferentes etapas del desarrollo hematopoyético usando 3 enfoques restringidos mediados por la recombinasa Cre para iniciar la expresión de HGAL en las células madre hematopoyéticas, las células pro-B o las células B del centro germinal. Tras la estimulación inmunológica, se observaron centros germinales más grandes en ratones en los que se inició la expresión de HGAL en células B del centro germinal, lo que puso de evidencia su implicación en el proceso tumorogénico: en el examen macroscópico estos animales presentaban una marcada esplenomegalia causada por grandes tumores, independientemente del promotor que controla la expresión de HGAL. Los tres modelos de ratón desarrollaron LCGBD con una frecuencia del 12% al 30% a partir de los 13 meses, lo que condicionó una supervivencia más corta: 21 meses, 20 meses y 16 meses de supervivencia específica media las cohortes de Rosa26HGAL/Aid-Cre, Rosa26HGAL/Mb1-Cre y Rosa26HGAL/Sca1-Cre, respectivamente. Los estudios inmunohistoquímicos revelaron que todos los linfomas eran del tipo BGC, con infiltración nodular difusa de los órganos afectados por grandes células linfoides pleomórficas que expresaban B220, PAX5, HGAL, PNA e IRF4. Además, en estos modelos murinos la sobreexpresión condicionada de HGAL dio lugar a una evidente afectación extraganglionar con afectación del hígado y de los ganglios linfáticos en los ratones Rosa26HGAL/Sca1-Cre, del riñón y del páncreas en los ratones Rosa26HGAL/Mb1-Cre y del riñón y del hígado en los ratones Rosa26HGAL/Aid- Cre. El estudio de microarrays puso de manifiesto la presencia de una marcada expresión diferencial entre las células con linfoma y los esplenocitos B normales en la que destacaba una sobreexpresión del regulador de la señalización de proteína G1 (RGS1), relacionado con la regulación de la migración celular y de RAB10. El análisis de los genes expresados diferencialmente entre las células esplénicas B de los tres modelos murinos en comparación con ratones control de la misma camada reveló un enriquecimiento en genes comunes a los tres modelos entre los que destacaba una sobreexpresión en los linfomas de la señalización de mTORC1, la respuesta de interferón, las dianas E2F y la señalización de la vía IL-6/JAK/STAT3. La secuenciación del exoma completo de 8 muestras de tumores murinos reveló la presencia de 124 mutaciones sin-sentido o de sentido erróneo en 110 genes, con una media de 15 por tumor (número similar a la mediana de 17 alteraciones genéticas por tumor encontradas en los LCGBD humanos). Algunos de los genes mutados ya habían sido descritos previamente en tumores humanos del tipo LCGBD, con 18 mutaciones detectadas previamente, de forma recurrente, en un 0.7% de los LCGBD humanos : PIM1, GNA13, FAS, PDF4DIP, NFKBIA y PTPN6. Posteriormente, la secuenciación del ARN mostró que todos los tumores murinos analizados expresaban BCL6. Es posible que la ausencia de expresión de BCL6 en algunos tumores con expresión de HGAL pudiera deberse a la estimulación mejorada del BCR con HGAL en estos tumores, tal y como se ha descrito en algunos estudios que muestran una disminución en la expresión de proteína proteica de BCL6. El análisis del reordenamiento de las inmunoglobulinas confirmó que todos los tumores de células B eran clonales y tenían mutaciones somáticas independientemente del impulsor del promotor encargado de la expresión de HGAL. Nuestros resultados demuestran que la expresión forzada constitutiva de HGAL conduce al desarrollo de LCGBD de tipo BCG. [EN] Diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL) are clinically and genetically heterogeneous tumors. Dysregulation of various biological processes specific to B cells, such as B cell receptor (BCR) signaling and regulation of motility, contribute to lymphomagenesis. Human germinal associated lymphoma (HGAL) protein is a specific adapter protein of B cells that controls their motility and BCR signaling. In normal B cells, the HGAL gene is expressed in the germinal center and is rapidly repressed. Most DLBCL, mainly those of the germinal center (GCB), although to a lesser extent those of the activated type (ABC), express HGAL. To investigate the consequences of constitutive expression of HGAL in vivo, we generated mice conditionally expressing human HGAL at different stages of hematopoietic development using 3-restricted Cre recombinase-mediated approaches to initiate HGAL expression in hematopoietic stem cells, pro-B or B cells of the germinal center. After immunological stimulation, larger germinal centers were observed in mice in which the expression of HGAL was initiated in B cells of the germinal center, which evidenced its involvement in the tumorigenic process: in the macroscopic examination these animals presented a marked splenomegaly caused by large tumors, regardless of the promoter that controls HGAL expression. The three mouse models developed DLBCL with a frequency of 12% to 30% from 13 months, leading to a shorter survival: 21 months, 20 months and 16 months of median specific survival in the Rosa26HGAL/Aid-Cre, Rosa26HGAL/Mb1-Cre and Rosa26HGAL/Sca1-Cre cohorts, respectively. Immunohistochemical studies revealed that all the lymphomas were of the SLNB type, with diffuse nodular infiltration of the affected organs by large pleomorphic lymphoid cells expressing B220, PAX5, ALGH, PNA, and IRF4. In addition, in these mouse models conditioned overexpression of HGAL resulted in evident extranodal involvement with involvement of the liver and lymph nodes in Rosa26HGAL/Sca1-Cre mice, kidney and pancreas in Rosa26HGAL/Mb1-Cre mice and kidney and liver in Rosa26HGAL/Aid-Cre mice. The microarray study revealed the presence of a marked differential expression between cells with lymphoma and normal B splenocytes, in which an overexpression of the regulator of signaling protein G1 (RGS1), related to the regulation of cell migration and RAB10. Analysis of differentially expressed genes between spleen B cells of the three mouse models compared with littermate control mice revealed an enrichment in genes common to all three models notable among them was an overexpression of B signaling in lymphomas of mTORC1, interferon response, E2F targets, and IL-6/JAK/STAT3 signaling pathway. Whole-exome sequencing of 8 murine tumor samples revealed the presence of 124 nonsense or missense mutations in 110 genes, with a mean of 15 per tumor (like the median of 17 genetic alterations per tumor found in the human DLBCL). Some of the mutated genes had already been previously described in human LCGBD-type tumors, with 18 mutations previously detected, recurrently, in 0.7% of human DLBCL: PIM1, GNA13, FAS, PDF4DIP, NFKBIA, and PTPN6. Subsequently, RNA sequencing showed that all murine tumors analyzed expressed BCL6. It is possible that the absence of BCL6 expression in some tumors with HGAL expression could be due to the enhanced stimulation of the BCR with HGAL in these tumors, as has been described in some studies showing a decrease in the expression of HGAL protein. Immunoglobulin rearrangement analysis confirmed that all B-cell tumors were clonal and had somatic mutations, regardless of the promoter drive responsible for HGAL expression. Our results demonstrate that constitutive forced expression of HGAL leads to the development of GCB-DLBCL. Our results demonstrate that constitutive forced expression of HGAL leads to the development of DLBCL.