Crk proteins activate the Rap1 guanine nucleotide exchange factor C3G by segregated adaptor-dependent and -independent mechanisms

Abstract

[SPA] C3G es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que activa Rap1 para promover la adhesión celular. C3G en reposo está auto-inhibido y se activa por fosforilación en tirosinas e interacción con proteínas adaptadoras Crk, cuya expresión está elevada en múltiples cánceres humanos. Sin embargo, los detalles moleculares de la activación de C3G son poco comprendidos. En este trabajo hemos combinado enfoques bioquímicos, biofísicos y de biología celular para dilucidar los mecanismos de activación de C3G. La unión de las proteínas adaptadoras Crk a cuatro motivos ricos en prolina (P1 a P4) en C3G se caracterizó in vitro mediante calorimetría de titulación isotérmica y velocidad de sedimentación, y en células Jurkat y HEK293T mediante ensayos de afinidad por pull-down. La actividad de intercambio de nucleótidos de C3G sobre Rap1 se midió utilizando ensayos cinéticos de disociación de nucleótidos. También se utilizaron células Jurkat para analizar la translocación de C3G a la membrana plasmática y la activación dependiente de C3G de Rap1 tras la ligadura de los receptores de células T. CrkL interactúa a través de su dominio SH3N con los sitios P1 y P2 de C3G inactivo in vitro y en células Jurkat y HEK293T, y estos sitios son necesarios para reclutar C3G a la membrana plasmática. Sin embargo, la estimulación directa de la actividad GEF requiere la unión de las proteínas Crk a los sitios P3 y P4. El sitio P3 está bloqueado en C3G en reposo y es esencial para la activación, mientras que el P4 contribuye de forma secundaria a la estimulación completa. La fosforilación en tirosinas de C3G por sí sola causa una activación marginal. En cambio, la fosforilación prepara a C3G reduciendo la concentración de proteínas Crk necesarias para la activación y aumentando la actividad máxima. Sorprendentemente, la activación óptima también requiere la interacción del dominio SH2 de CrkL con C3G fosforilado. En conclusión, nuestro estudio revela que la fosforilación de C3G por Src y la unión a Crk forman un mecanismo de dos factores que garantiza un control estricto de la activación de C3G. Además, la interacción simultánea de los dominios SH2 y SH3N de CrkL con C3G, necesaria para la activación, revela una nueva función independiente de adaptadores de las proteínas Crk, relevante para comprender su papel en la señalización fisiológica y su desregulación en enfermedades.