Caracterización molecular de la neurofibromatosis tipo 1 y el síndrome de Legius

Abstract

[ES] Las RASopatías asociadas a alteraciones en los genes NF1 y SPRED1 presentan una marcada heterogeneidad clínica y molecular, donde el principal obstáculo tras el diagnóstico genético es la interpretación funcional de las variantes identificadas. Con el objetivo de superar este desafío, la presente tesis doctoral ha creado un flujo de trabajo experimental multidisciplinar que combina el análisis de variantes en NF1 y SPRED1 reportadas en bases de datos públicas y de pacientes de la DIERCyL, el modelado estructural y de estabilidad proteica in silico, la señalización celular, proliferación, y morfometría en las líneas celulares HEK293T y NIH3T3. Los análisis de las bases de datos genéticas identificaron hotspots estructurales críticos en la proteína neurofibromina (CSRD, GRD y Armadillo1), mientras que las variantes en SPRED1 mostraron una distribución homogénea, sugiriendo mecanismos patogénicos distintos. En el caso de las variantes en NF1 y SPRED1 de los pacientes, el análisis energético reveló un espectro continuo en neurofibromina que va desde haploinsuficiencia hasta dominancia negativa en truncantes tardías, mientras que en SPRED1 predominó la pérdida de función. Los ensayos celulares in vitro, mostraron dinámicas de señalización celular diferentes según el tipo de variante analizada en los genes NF1 y SPRED1. En particular, la hiperactivación de ERK emergió como el evento molecular más determinante para la patogenicidad de las variantes. La coactivación de p38 identificó variantes de mayor severidad clínica, mientras que la relación inversa p- ERK/p-AKT(Ser473) reveló un circuito de retroalimentación negativa entre las rutas de señalización MAPK y PI3K/AKT. Los ensayos de proliferación celular y el análisis cuantitativo del tamaño celular revelaron fenotipos consistentes con el grado de desregulación de MAPK, proporcionando biomarcadores fenotípicos adicionales para diferenciar entre variantes patogénicas y benignas en ambos genes. La relevancia tisular de HEK293T (contextos epiteliales/neuroectodérmicos) y NIH3T3 (mesenquimales) permitió reproducir la heterogeneidad clínica observada en pacientes. Los resultados de esta tesis doctoral han permitido reclasificar variantes de significado incierto en ambos genes e identificar la hiperactivación de ERK como diana terapéutica prioritaria, apoyando el uso de inhibidores de MEK en contextos compatibles con esta desregulación. En conjunto, este trabajo establece un marco integral para la interpretación funcional de variantes en RASopatías y para el desarrollo de futuras estrategias de medicina personalizada.

[EN] RASopathies associated with alterations in the NF1 and SPRED1 genes exhibit marked clinical and molecular heterogeneity, where the main challenge after genetic diagnosis lies in the functional interpretation of the identified variants. To address this issue, this doctoral thesis established a multidisciplinary experimental workflow that integrates the analysis of NF1 and SPRED1 variants reported in public databases and in patients from the DIERCyL cohort, together with in silico structural and protein-stability modeling, cellular signaling assays, proliferation studies, and morphometric analyses in HEK293T and NIH3T3 cell lines. Database analyses identified critical structural hotspots in neurofibromin (CSRD, GRD, and Armadillo1), whereas SPRED1 variants showed a more homogeneous distribution, suggesting distinct pathogenic mechanisms. In patient-derived NF1 and SPRED1 variants, energy-based analyses revealed a continuous spectrum in neurofibromin, ranging from haploinsufficiency to dominant-negative effects in late truncating variants, while SPRED1 alterations predominantly showed loss-of-function behavior. The in vitro cellular assays revealed distinct signaling dynamics depending on the type of variant analyzed in NF1 and SPRED1. Notably, ERK hyperactivation emerged as the most determinant molecular event for pathogenicity. Co-activation of p38 identified variants associated with more severe clinical outcomes, whereas the inverse p-ERK/p- AKT(Ser473) relationship revealed a negative feedback circuit between the MAPK and PI3K/AKT pathways. Cell-proliferation assays and quantitative cell-size analyses uncovered phenotypes consistent with the degree of MAPK deregulation, providing additional phenotypic biomarkers to discriminate between pathogenic and benign variants in both genes. The tissue relevance of HEK293T (epithelial/neuroectodermal contexts) and NIH3T3 (mesenchymal) cells allowed us to recapitulate the clinical heterogeneity observed in patients. The results of this doctoral thesis enabled the reclassification of variants of uncertain significance in both genes and identified ERK hyperactivation as a priority therapeutic target, supporting the use of MEK inhibitors in contexts consistent with this dysregulation. Taken together, this work establishes a comprehensive framework for the functional interpretation of variants in RASopathies and for the development of future personalizedmedicine strategies.