Desarrollo de estrategias analíticas para la determinación de nucleósidos y nucleobases metilados en orina mediante espectrometría de masas: correlación con biomarcadores exógenos

Abstract

[ES] La monitorización de modificaciones epigenéticas en el ARN a través de la cuantificación de nucleósidos y nucleobases metilados en fluidos biológicos representa un área esencial de la investigación biomédica actual. Estos compuestos actúan como biomarcadores endógenos que reflejan el estado fisiopatológico del organismo. Sin embargo, su análisis en orina humana supone un reto analítico considerable debido a la complejidad de la matriz, la baja concentración de los analitos y la presencia de isómeros estructurales. En este trabajo, se presenta el desarrollo y validación de diversas metodologías analíticas basadas en espectrometría de masas en tándem (MS/MS) diseñadas para mejorar la sensibilidad y la capacidad de procesamiento de muestras en el estudio de estos biomarcadores. Para abordar estos retos, inicialmente se implementó una plataforma avanzada que combina la microextracción en fase sólida miniaturizada en formato tip-on-tip (TOT-µSPE) con la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC-MS/MS). Esta estrategia permitió una limpieza exhaustiva de la matriz y la separación eficiente de diez nucleósidos y cinco nucleobases metilados. Complementariamente, con el fin de aumentar el rendimiento analítico para estudios a gran escala, se desarrolló un método de cribado rápido mediante inyección en flujo (FIA-MS/MS). Esta aproximación no separativa logró reducir los tiempos de análisis, permitiendo procesar hasta 24 muestras por hora, lo que supone una mejora de diez veces en la productividad respecto a los métodos cromatográficos convencionales. La utilidad clínica y ambiental de estas herramientas se evaluó mediante un estudio poblacional en 61 voluntarios, donde se exploró la relación entre estos marcadores de metilación endógena y la exposición a contaminantes ambientales, específicamente mediante la cuantificación de metabolitos de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs). Los resultados obtenidos tras la validación —con recuperaciones entre el 85% y el 120%— revelaron correlaciones significativas entre la exposición exógena y la alteración de los niveles de nucleósidos metilados. Estos hallazgos sugieren que factores externos como la contaminación pueden influir en la dinámica epigenética a través de mecanismos de estrés oxidativo. En conjunto, esta investigación proporciona una plataforma robusta y versátil para la detección precoz de enfermedades y el avance hacia una medicina personalizada basada en la monitorización mediante toma de muestra no invasiva de biomarcadores.