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Título
Role of C3G in B cell lymphoma and characterization of C3G-blocking nanobodies
Autor(es)
Director(es)
Materia
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Linfoma de células B
Proteínas G
Anticuerpos monoclonales
Clasificación UNESCO
2302.27 Proteínas
2412.02 Anticuerpos
3207.08 Hematología
Fecha de publicación
2024
Resumen
[ES]C3G, también conocido como RapGEF1, es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que activa varias GTPasas de la familia Ras, especialmente Rap1. C3G se expresa de manera ubicua y regula la adhesión celular, migración, proliferación, apoptosis, supervivencia y diferenciación. La secuencia de la variante principal de C3G humano cuenta con tres segmentos distintos, dos de los cuales son regiones no catalíticas. El dominio Nterminal (NTD) media la unión a E-cadherina, mientras que la región central o SH3b está involucrada en interacciones proteína-proteína a través de motivos ricos en prolina. La región
catalítica C-terminal consiste en un motivo de intercambio de Ras (REM) y un dominio de homología a Cdc25 (Cdc25HD). La actividad de C3G se mantiene en un estado autoinhibido mediante una interacción intramolecular. El segmento C-terminal del dominio SH3b alberga una región autoinhibitoria (AIR) que se une al Cdc25HD, bloqueando su actividad. La desregulación de la vía de señalización C3G-Rap1 está asociada con varias condiciones patológicas. C3G tiene un papel dual en los procesos tumorigénicos, actuando como promotor o supresor tumoral dependiendo del contexto celular. Además, la señalización por Rap1 está implicada en tumores hematológicos. Resultados previos de nuestro grupo identificaron una mutación de cambio de sentido en un paciente con linfoma no Hodgkin (Y554H), la cual afecta a la AIR y causa la activación constitutiva de C3G. Por lo tanto, en esta tesis hemos investigado el impacto de la desregulación de C3G en el desarrollo de linfomas. Hemos combinado técnicas bioquímicas, biofísicas y de biología celular, así como modelos animales, para estudiar el impacto de la desregulación catalítica de C3G sobre la biología de células de linfoma. Para ello, utilizamos el sistema de edición CRISPR/Cas9 para introducir la mutación Y564H (equivalente a Y554H humano) en el gen endógeno Rapgef1, que codifica para C3G, en la línea murina de linfoma de células B A20. Confirmamos mediante secuenciación de Sanger la generación de cinco clones mutantes, denominados A20-C3GY564H seguidos por sus respectivos números, -169, -191, -195, -201 y -221. Paralelamente, utilizamos tres clones control con la secuencia de C3G silvestre, designados A20-C3G-WT-1, -2 y -3. Confirmamos que los niveles de proteína C3G eran similares entre las células editadas y las control, excepto en las células A20-C3G-Y564H-195, que mostraron una menor expresión de C3G. Los clones generados A20-C3G-Y564H se han utilizado para estudiar la desregulación catalítica de C3G en este modelo de linfoma. Investigamos el efecto de la mutación Y564H en las células editadas sobre la actividad catalítica GEF de C3G hacia la GTPasa Rap1. Las células A20-C3G-Y564H presentaron mayores niveles de Rap1 activo que las células A20-C3G-WT, tanto en estado basal como tras la estimulación del receptor de células B (BCR). El hecho de que el mutante C3G-Y564H responda a la activación del BCR en células B sugiere que la disrupción de la interacción autoinhibitoria en C3G no compromete otros mecanismos regulatorios, y que C3G-Y564H puede activarse aún más, probablemente a través de su reclutamiento a la membrana, a pesar de estar constitutivamente activo. Dado que el aumento de la proliferación celular se ha asociado con procesos tumorigénicos, analizamos la proliferación de las células editadas utilizando varias técnicas. Confirmamos que las células A20-C3G-Y564H tenían una menor tasa de proliferación que las células A20-C3G-WT, lo que sugiere que C3G actúa como supresor tumoral en este sistema. Su reducida proliferación podría estar asociada con alteraciones en la vía Ras-ERK1/2, por lo que analizamos el impacto de C3G-Y564H sobre esta vía. Aunque la actividad de la GTPasa Ras no estaba alterada en las células A20-C3G-Y564H, estas mostraron menores niveles de la quinasa Raf. Además, la activación de las quinasas aguas abajo, MEK1/2 y ERK1/2, era menor en las células A20-C3G-Y564H que en las células A20-C3G-WT, tanto en condiciones basales como tras la estimulación del BCR. Esto se acompañaba de niveles alterados de varios genes relacionados con las MAPKs en las células A20-C3G-Y564H. La menor fosforilación de ERK1/2 en las células A20-C3G-Y564H no dependía de la activación de PP2A. Por lo tanto, el efecto de C3G-Y564H en la vía Ras-ERK1/2 puede estar relacionado con el secuestro de c-Raf por parte de Rap1 hiperactivo. También analizamos el efecto del mutante C3G-Y564H en procesos apoptóticos. Las células A20-C3G-Y564H mostraron una mayor apoptosis que las células A20-C3G-WT, lo que se correlacionó con niveles más bajos de Bcl-xL. Dado que la adhesión celular es otro proceso crucial en la tumorigénesis, investigamos el impacto de la mutación C3G-Y564H sobre las interacciones célula-matriz mediadas por integrinas. Las células A20-C3G-Y564H mostraron una menor interacción con fibrinógeno soluble, consistente con su menor adhesión a fibrinógeno inmovilizado. Esta reducción fue más pronunciada tras la activación por PMA, que induce la fosforilación de C3G. No encontramos diferencias en la expresión de las integrinas LFA-1 y VLA-4 en la superficie celular, ni en los niveles totales de Talina-1. Esto sugiere que otra(s) proteína(s) podría/n intervenir en la menor adhesión a fibrinógeno observada en las células A20-C3G-Y564H. Todos los resultados anteriores son consistentes con un efecto anti-tumorigénico/supresor tumoral del mutante C3G-Y564H. También exploramos la migración e invasión de las células A20-C3G-Y564H, demostrando que las células mutantes tenían una mayor capacidad para migrar e invadir hacia CXCL12. Este fenotipo estaría más asociado con un fenotipo pro-tumorigénico, en contraste con los hallazgos obtenidos en los ensayos de proliferación celular, apoptosis y adhesión. Investigamos la activación de las principales GTPasas Rho asociadas con la biología de linfocitos, ya que juegan un papel crucial en la dinámica del citoesqueleto y regulan la adhesión, migración e invasión celular. Tras la estimulación del BCR, no se encontró alteración de Cdc42 en células A20-C3G-Y564H en comparación con células A20-C3G-WT, mientras las células mutadas sí presentaron una activación reducida de las proteínas Rac, especialmente Rac2, por lo que Rac2 podría ser un mediador importante de la función de C3G en las células de linfoma. Para dilucidar el efecto in vivo del mutante C3G-Y564H sobre la progresión de linfomas, caracterizamos un modelo tumoral singénico en el que células A20- C3G-WT o A20-C3GY564H se inyectaron en la vena de la cola de ratones BALB/c. Confirmamos que las células A20-C3G-WT tenían la capacidad de diseminarse e infiltrar en el hígado y el bazo, consistente
con la capacidad tumorigénica y metastásica de las células A20. La inyección de células A20-C3G-Y564H resultó en un crecimiento tumoral ligeramente mayor, pero este aumento solo fue significativo en el caso del clon A20-C3G-Y564H-195. Esto sugiere que el mayor potencial tumorigénico de este clon particular podría estar relacionado principalmente con la menor
expresión de C3G, y no con su desregulación catalítica. De hecho, la comparación de los resultados entre los diferentes clones A20-C3G-Y564H y las células control sugiere un equilibrio entre los efectos mediados por Rap1 (tanto anti- como pro-tumorigénicos) y los efectos mediados por Rac2 (principalmente anti-tumorigénicos) en las células A20. Los resultados anteriores demostraron que una mutación puntual en C3G que conduce a su desregulación catalítica tiene un impacto en diferentes características propias del cáncer. Por tanto, estábamos interesados en desarrollar inhibidores de C3G para evaluar el uso de C3G como potencial diana terapéutica. Identificamos 12 familias de nanocuerpos que interactúan específicamente con el dominio Cdc25H. Ensayos bioquímicos adicionales confirmaron que diferentes nanocuerpos anti-Cdc25HD reconocían múltiples epítopos dentro de este dominio catalítico. De ellos, el nanocuerpo Nb-750 mostró una mayor unión tanto a C3G silvestre como al mutante C3G-Y554H, sin interrumpir la interacción autoinhibitoria de C3G. A su vez, el Nb-800 competía con el AIR por la unión al Cdc25HD, mostrando una unión preferencial al mutante C3G-Y554H constitutivamente activo. Utilizando métodos biofísicos para caracterizar estas interacciones, observamos que la unión de Cdc25HD a estos nanocuerpos ocurría con una afinidad micromolar, siendo el Nb-750 el que mostraba la mayor afinidad por Cdc25HD. Tres nanocuerpos, incluidos Nb-750 y Nb-800, bloquearon la actividad GEF tanto de Cdc25HD aislado como del mutante C3G-Y554H, aunque este último con menor eficiencia. Estos resultados sugerían diferencias conformacionales en los epítopos reconocidos por estos nanocuerpos. En conjunto, estos resultados allanan el camino para emplear nanocuerpos anti-Cdc25HD como potentes herramientas para bloquear los efectos celulares de la actividad GEF de C3G. En conclusión, la expresión de una forma desregulada de C3G está asociada con la alteración de las propiedades tumorigénicas de células de linfoma, lo que apoya la implicación de C3G en la tumorigénesis de este tipo celular. Este trabajo tiene implicaciones para comprender el papel de Rap1 en tumores hematopoyéticos, así como para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas dirigidas contra la vía C3G-Rap1.
URI
DOI
10.14201/gredos.159670
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