Microbioma y resistoma de quirópteros en túneles con influencia antropogénica: una aproximación metagenómica

Abstract

[ES] Los murciélagos (quirópteros) son el segundo orden de mamíferos más numeroso conocido, contando con cerca del veinte por ciento de las especies descritas hasta la fecha. Este grupo es de especial importancia en salud y epidemiología debido a que habitan en zonas cercanas a asentamientos humanos y/o instalaciones de cría de animales. Características intrínsecas y extrínsecas a los murciélagos los hacen hospedadores de una amplia variedad de patógenos humanos. Para establecer su presencia se pueden utilizar técnicas moleculares de amplificación de ácidos nucleicos específicas o estudios metagenómicos que permiten determinar la composición y dinámicas del microbioma de interés. Uno de los refugios de quirópteros más grandes e importantes que existen en la provincia de Salamanca se encuentra en la región del parque Natural Arribes del Duero, que incluye la ruta turística de ‘el Camino de Hierro’. Esta ruta está compuesta por puentes y túneles que en su interior albergan colonias de quirópteros de hasta 12.000 individuos pertenecientes a 16 especies, todas ellas protegidas por la legislación europea (Hábitats Directiva), estatal (ley 42/2007 del Patrimonio Natural y de la Biodiversidad) y Catálogo Español de Especies Amenazadas (RD 139/2011). A pesar de contar con esta gran cantidad de colonias y la potencial abundancia de posibles patógenos, actualmente la ruta sirve como sitio turístico recreativo, recibiendo la visita de miles de personas anualmente. Con este contexto como base, nos planteamos la hipótesis de esta Tesis Doctoral, ya que el microbioma del guano de murciélagos en áreas con alta presión turística pudiera albergar microorganismos con potencial zoonótico. Además, las comunidades microbianas asociadas a colonias de murciélagos en zonas turísticas pueden presentar una mayor abundancia y diversidad de genes de resistencia a antibióticos en comparación con colonias en zonas sin actividad humana, lo que sugiere una influencia antropogénica en la selección de resistencia antimicrobiana en estos ecosistemas. Esta hipótesis se fundamentó en los resultados de los artículos de revisión bibliográfica presentados como introducción. Durante el desarrollo de la introducción, se define un inventario de la riqueza de bacterias encontradas en guano de murciélagos en los últimos cinco años (2020-2025) mediante la metagenómica como herramienta de detección. Se describen las bacterias identificadas en los diferentes estudios realizados y que pueden ser de relevancia en nuestra investigación debido a la capacidad de transmisión por partículas suspendidas en el aire. A continuación, se analiza las bacterias que han presentado resistencia a antimicrobianos en los artículos de investigación publicados en los últimos cinco años, así como las características de los estudios realizados, incluyendo el método de identificación bacteriana, pruebas para la detección de resistencias y metodologías estadísticas utilizadas. De esta manera, propusimos como objetivo general evaluar el impacto de la presión antropogénica en la composición del microbioma y en la presencia de genes de resistencia a antibióticos en colonias de murciélagos del Parque Natural de las Arribes del Duero, con énfasis en su relevancia para la salud pública. Para ello, definimos distintos objetivos específicos que se van alcanzando en los diferentes artículos de investigación presentados en esta Tesis Doctoral. El primer objetivo específico se basa en caracterizar la diversidad taxonómica y funcional del microbioma bacteriano presente en el guano de murciélagos en túneles del Camino de Hierro durante dos temporadas (periodo de reproducción y periodo de hibernación), utilizando metagenómica por shotgun y análisis bioinformáticos. Así, fuimos capaces de describir la comunidad bacteriana a nivel taxonómico y funcional. Como segundo objetivo específico se planteó la detección de patógenos específicos en túneles transitados por personas, por su potencial zoonótico. Se identificó mediante diagnóstico molecular (PCR-nested; reacción en cadena de la polimerasa anidada) y secuenciación, hongos del género Histoplasma por primera vez en la Península Ibérica a partir de muestras de heces de quirópteros alojados en dichos túneles. El tercer objetivo específico se enfocó en identificar y cuantificar genes de resistencia a antibióticos (ARGs; Antibiotic resistance genes) en los metagenomas obtenidos, comparando su abundancia, diversidad y contexto genómico con muestras obtenidas en regiones con cuevas sin exposición a la actividad humana. Es decir, se compararon regiones con alta y baja presión antropogénica. Para ello, ensamblamos genomas de muestras de guano del Camino de Hierro, Salamanca, España (alta exposición a personas), con muestras de una zona en Guangdong, China, sin dicha influencia de las personas (baja exposición). Identificamos y comparamos los ARGs y realizamos la búsqueda de genes homólogos humanos de la base de datos CARD (Comprehensive Antibiotic Resistance Database). Los resultados indicaron que la presión antropogénica ha modificado el ambiente, ya que se encontraron genes de resistencia bacteriana en las muestras procedentes de Salamanca, que no habían sido identificados en las muestras de Guangdong. En conjunto, los resultados de esta investigación evidencian que los túneles del Camino de Hierro (un entorno turístico frecuentado anualmente por miles de visitantes), albergan un microbioma asociado al guano de murciélagos con una notable carga de microorganismos de relevancia clínica. Mediante nuestro enfoque metagenómico, se caracterizó la diversidad taxonómica y funcional de este microbioma, identificándose bacterias potencialmente patógenas para el ser humano y hongos de gran importancia en salud pública, incluidos en el género Histoplasma. Asimismo, el análisis comparativo de genomas bacterianos ensamblados a partir de muestras del Camino de Hierro y de un entorno silvestre en Guangdong (China) sugiere que la actividad turística y humana ha ejercido una presión selectiva que modifica el reservorio natural de resistencia antimicrobiana en estos ecosistemas. Estos hallazgos pueden tomarse como una alerta científica sobre los riesgos potenciales derivados de la apertura de cavidades naturales a la actividad turística sin una evaluación previa de bioseguridad. La gestión sostenible de estos espacios debe considerar estrategias de vigilancia microbiológica y medidas preventivas orientadas a proteger tanto a los visitantes como a los trabajadores, así como a preservar la integridad ecológica de las colonias de murciélagos.

[EN] Bats (Order Chiroptera) constitute the second most numerous order of mammals known to date, representing approximately twenty percent of all described mammalian species. This group holds particular relevance in public health and epidemiology due to their frequent habitation of areas adjacent to human settlements and/or livestock facilities. Both intrinsic and extrinsic characteristics of bats render them suitable hosts for a wide variety of human pathogens. Their presence can be confirmed through specific molecular nucleic acid amplification techniques or metagenomic studies that enable the characterization of the composition and dynamics of the microbiome of interest. One of the largest and most significant bat roosts in the province of Salamanca is located within the Arribes del Duero Natural Park, encompassing the tourist route known as “El Camino de Hierro.” This route comprises bridges and tunnels that harbor bat colonies of up to 12,000 individuals belonging to 16 different species, all of which are protected under European legislation (Habitats Directive), national law (Law 42/2007 on Natural Heritage and Biodiversity), and the Spanish Catalogue of Threatened Species (Royal Decree 139/2011). Despite hosting such substantial bat colonies and the potential abundance of associated pathogens, this route currently functions as a recreational tourist site, receiving thousands of visitors annually. Within this context, the central hypothesis of this doctoral thesis was formulated: the microbiome present in bat guano from areas subjected to high tourism pressure may harbor microorganisms with zoonotic potential. Furthermore, microbial communities associated with bat colonies in tourist areas may exhibit greater abundance and diversity of antibiotic resistance genes compared to those in colonies located in areas devoid of human activity, suggesting anthropogenic influence on the selection of antimicrobial resistance in these ecosystems. This hypothesis was grounded in the findings of the literature review articles presented in the Introduction. During the development of the Introduction, an inventory of bacterial taxa identified in bat guano over the past five years (2020–2025) was compiled using metagenomics as the primary detection tool. Bacterial species reported in various studies were described, with emphasis placed on those relevant to our research due to their capacity for airborne transmission via aerosolized particles. Subsequently, bacteria exhibiting antimicrobial resistance in published research from the last five years were analyzed, along with the methodological characteristics of these studies, including bacterial identification techniques, antimicrobial resistance detection assays, and statistical methodologies employed. Accordingly, the general objective of this thesis was to evaluate the impact of anthropogenic pressure on the composition of the bat guano microbiome and on the presence of antibiotic resistance genes (ARGs) in bat colonies inhabiting the Arribes del Duero Natural Park, with a focus on implications for public health. To achieve this overarching goal, several specific objectives were defined and addressed across the individual research articles comprising this doctoral dissertation. The first specific objective was to characterize the taxonomic and functional diversity of the bacterial microbiome present in bat guano collected from tunnels along El Camino de Hierro during two distinct seasons (reproductive and hibernation periods), using shotgun metagenomics coupled with bioinformatic analyses. This approach enabled comprehensive description of the bacterial community at both taxonomic and functional levels. The second specific objective focused on the detection of specific pathogens with zoonotic potential in tunnels frequented by humans. Using molecular diagnostic methods (nested PCR) and sequencing, fungi of the genus Histoplasma were identified for the first time on the Iberian Peninsula from fecal samples of bats roosting in these tunnels. The third specific objective aimed to identify and quantify antibiotic resistance genes (ARGs) within the obtained metagenomes, comparing their abundance, diversity, and genomic context between samples collected from sites with high versus low anthropogenic pressure, specifically, tunnels along El Camino de Hierro (Salamanca, Spain; high human exposure) and caves in Guangdong, China (low human exposure). Metagenome-assembled genomes from both locations were compared; ARGs were identified and cross-referenced against homologous human-associated genes in the Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD). Results indicated that anthropogenic pressure has altered the microbial environment, as bacterial resistance genes detected in Salamanca samples were absent in those from Guangdong. Collectively, these findings demonstrate that the tunnels of El Camino de Hierro, a tourist destination visited annually by thousands, harbor a bat guano-associated microbiome carrying a notable burden of clinically relevant microorganisms. Through our metagenomic approach, we characterized the taxonomic and functional diversity of this microbiome, identifying bacteria potentially pathogenic to humans as well as fungi of major public health significance within the genus Histoplasma. Moreover, comparative analysis of bacterial genomes assembled from samples collected at El Camino de Hierro and from a pristine cave system in Guangdong (China) suggests that tourism and human activity exert selective pressure that modifies the natural reservoir of antimicrobial resistance in these ecosystems. These results serve as a scientific warning regarding the potential risks associated with opening natural cavities to tourism without prior biosafety assessments. Sustainable management of such spaces must incorporate microbiological surveillance strategies and preventive measures designed to protect both visitors and staff, while simultaneously preserving the ecological integrity of bat colonies.