Engineering a dual stimuli-responsive platform for post-surgical breast cancer treatment

Abstract

[ES] Esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de una plataforma dual termo/pH-sensible para el tratamiento localizado del cáncer de mama tras la resección quirúrgica del tumor para la erradicación de células tumorales en el tejido mamario y prevención de recurrencias locales. El objetivo principal ha sido combinar la administración local de fármacos, mediante el desarrollo de una matriz de hidrogel inyectable y termosensible, con mecanismos de liberación pH-sensible basados en nanocarriers, capaces de aumentar la eficacia terapéutica y reducir los efectos adversos de las terapias sistémicas convencionales. La novedad en esta tesis doctoral respecto a los sistemas de respuesta dual reportados reside en la transferencia de la pH-sensibilidad de la matriz del hidrogel al nanocarrier incorporado, estableciendo un proceso de síntesis y optimización de las estrategias en cada componente del sistema híbrido de forma paralela, presentando la oportunidad de un diseño más adaptable a cada estrategia y mayor potencial sinérgico, incrementando su actividad anticancerígena. La primera etapa de la investigación estuvo dedicada al estudio de coacervados basados en alginato y gelatina A, buscando la síntesis del nanocarrier pH-sensible. Se analizó de forma detallada la influencia de variables como el pH, la temperatura de síntesis, el pretratamiento térmico de la gelatina y la relación Alginato:Gelatina A. Los resultados demostraron que el estado estructural de la gelatina desempeña un papel fundamental en la formación y estabilidad de los coacervados. El calentamiento favoreció el desenredo parcial de las cadenas de gelatina, permitiendo obtener coacervados más homogéneos y estables, incrementando el número de interacciones electrostáticas. La caracterización mediante dispersión dinámica y estática de luz (zetasizer) y turbidimetría permitió identificar formulaciones con tamaños nanométricos y baja polidispersión. Sin embargo, se observó un fenómeno de histéresis térmica por el cual las propiedades de los coacervados se deterioraban tras varios días a temperatura ambiente, a pesar de poder recuperarse parcialmente mediante ciclos de recalentamiento. Este comportamiento también fue confirmado mediante estudios reológicos, que pusieron de manifiesto la incompatibilidad de estas partículas coacervadas con una matriz que pudiera ser usada como reservorio de principios activos en administración local. Por lo tanto, la siguiente etapa de la tesis estuvo centrada en el desarrollo de otra alternativa para el componente pH-sensible del sistema dual. Para ello se sintetizaron liposomas mediante hidratación de capa fina y extrusión, optimizando tanto las condiciones de preparación como la composición lipídica. Los sistemas obtenidos presentaron tamaños próximos a 100 nm, muy baja polidispersión y una elevada estabilidad por periodos superiores a 3 semanas. Para conferir la pH-sensibilidad, se desarrolló una estrategia basada en el recubrimiento de liposomas con polímeros Eudragit (EU). Más concretamente, el uso de dos formulaciones que presentaban perfiles de liberación con respuesta opuesta al pH se llevó a cabo para expandir el uso de liberaciones de fármaco en sistemas liposomales. Para el primer recubrimiento (EU S100, liberaciones alcalinas) fue necesario modificar previamente la carga superficial de los liposomas mediante estearilamina, permitiendo posteriormente su recubrimiento mediante interacciones electrostáticas, formando agregados micrométricos. Por otro lado, el recubrimiento con EU EPO (liberaciones ácidas) sí presentó sistemas coloidales de tamaños nanométricos. Los estudios de tamaño, potencial zeta y microscopía confirmaron la formación de estructuras recubiertas estables y reproducibles. Una vez seleccionadas las formulaciones más prometedoras, se evaluó la encapsulación y liberación del fármaco antitumoral 5-fluorouracilo (5FU). La eficiencia de encapsulación superó el 90% y los ensayos de liberación demostraron una clara dependencia del pH. Los sistemas recubiertos mostraron una capacidad significativamente mayor para modular la liberación dentro de cada rango de respuesta de la formulación de EU seleccionada, validando la estrategia de respuesta al pH. Adicionalmente, se estudió validación biológica de los sistemas desarrollados. Para ello se realizó una estancia de investigación en la Universidad de Birmingham, donde se adquirió experiencia en cultivos celulares y técnicas de evaluación de actividad terapéutica. En primer lugar, se determinó la sensibilidad al 5FU de fibroblastos sanos HS-5 y de la línea celular de cáncer de mama BT-474. Posteriormente, los estudios de viabilidad celular demostraron que las formulaciones liposomales eran biocompatibles. Adicionalmente, cuando el fármaco era encapsulado, las formulaciones pH-sensibles mostraban un comportamiento dependiente del microambiente celular. Teniendo en cuenta la aplicación en terapias anticancerígenas, los liposomas recubiertos con Eudragit EPO combinaron una elevada internalización celular con una liberación favorecida en condiciones ácidas. Como resultado, se alcanzaron niveles de mortalidad superiores al 95% en células tumorales, manteniendo simultáneamente una elevada viabilidad en fibroblastos sanos, confirmado la compatibilidad con la aplicación. Posteriormente, la investigación se orientó hacia el desarrollo de hidrogeles termosensibles basados en el poloxámero PF-127. Este polímero presenta la capacidad de formar geles al aumentar la temperatura debido a fenómenos de agregación micelar, lo que lo convierte en un candidato atractivo para aplicaciones inyectables. Sin embargo, los hidrogeles obtenidos únicamente con PF-127 mostraban una liberación demasiado rápida del fármaco. Con el fin de reforzar la estructura del hidrogel, se estudió la incorporación de diferentes polisacáridos con diferentes conformaciones estructurales: alginato (lineal), goma gellan (ramificado), goma santana (helicoidal) y levan (coloides auto-ensamblados). Cada uno de ellos mostró interacciones específicas con la red micelar del poloxámero, mejorando su comportamiento reológico, su temperatura de gelificación y su estabilidad estructural. Los ensayos reológicos demostraron que la incorporación de polisacáridos permitía mantener la transición sol-gel a temperaturas compatibles con la aplicación biomédica, mientras que aumentaba su elasticidad y resistencia. En estudios de liberación de fármaco, los hidrogeles con polisacáridos incorporados eliminaron prácticamente la liberación rápida inicial observada en el poloxámero puro, y prolongaron la liberación del fármaco más de cuatro veces respecto al sistema original. Estos resultados confirmaron que la incorporación de polisacáridos reducía la porosidad efectiva de la red y dificultaba tanto la difusión del medio como la degradación de la estructura, soportados por tasas de degradación y constantes cinéticas obtenidas por el ajuste a un modelo matemático. Una vez optimizados ambos componentes por separado, los liposomas pH-sensibles fueron incorporados a la matriz del hidrogel termosensible para generar la plataforma híbrida de respuesta dual. Los estudios reológicos confirmaron que la presencia de los liposomas no alteraba la capacidad de agregación micelar del poloxámero. Adicionalmente, su combinación permitió conservar el comportamiento dual del sistema. Los hidrogeles mostraron una elevada biocompatibilidad y mantuvieron la capacidad de liberar selectivamente el fármaco hacia entornos tumorales. Aunque la liberación fue más lenta debido a la resistencia difusional impuesta por la matriz polimérica, la actividad terapéutica siguió siendo eficiente. Finalmente, la formulación híbrida fue evaluada en esferoides tridimensionales de cáncer de mama, un modelo más representativo del entorno tumoral real. Los resultados demostraron una capacidad superior para desintegrar la estructura de los esferoides y reducir la viabilidad celular respecto al fármaco libre. En conjunto, los resultados obtenidos validan una estrategia basada en la combinación de un hidrogel termosensible inyectable y liposomas pH-sensibles como plataforma para el tratamiento localizado del cáncer de mama post-quirúrgico. El sistema desarrollado permitió aprovechar simultáneamente la administración local, la liberación sostenida y el direccionamiento hacia el microambiente tumoral, constituyendo una alternativa prometedora para futuras aplicaciones en terapia postquirúrgica.

[EN] Nowadays, the procedure for an early stage non-metastatic diagnosed breast cancer is the breast-conserving therapy, consisting of tumour resection therapy by lumpectomy followed by breast irradiation to prevent local recurrences. Despite late advances, the radiotherapy off-targeting toxicity, as well as the alternative chemotherapies based on drug delivery systems systemically administered present major drawbacks. The poor therapeutic efficiency, resulting from limited drug accumulation at tumour site, together with systemic toxicity, constitute the main limitations of systemic administration. Since residual tumour cells responsible for recurrence are predominantly located within the surgical bed, the development of local therapies targeting these cells can help overcome the current limitations associated with tumour relapse. Therefore, this doctoral thesis addresses this challenge through the design and development of a dual stimuli-responsive local drug delivery platform for post-surgical therapy which presents combined thermo-sensitivity by an injectable hydrogel matrix, and pH-sensitivity by an engineered nanocarrier. These responses exploit two basic features that can be found in the surgical bed: Physiological temperature to induce gelation after injection, providing a locally administered strong drug depot, and the acidic tumour microenvironment, providing a reproducible targeting strategy. The final drug delivery system is based on a PF-127 hydrogel network incorporating Eudragit® EPO coated liposomes encapsulating the anticancer drug 5-fluorouracil (5-FU) as a model chemotherapeutic agent. However, the first approach consisted of developing alginate-gelatin A coacervates for pH-responsive strategy. Their synthesis optimization was accomplished by the study of process variables, including temperature and pH, obtaining nano sized coacervates systems of 500-750 nm with low polidispersity index (PDI <0.25). Nonetheless, their dependence on temperature and pH resulted in instability under physiological conditions, preventing their use for the intended application. Consequently, new pH-responsive approaches were explored. In this case, liposomes were selected due to their current use in clinic, showing their high biocompatibility, efficiency, and versatility as vesicles resembling cellular membranes. Conventional liposomes were successfully synthesized and optimized via sonication and extrusion, obtaining a stable small unilamellar vesicle system (85 nm) with narrow size distribution (PDI < 0.1) for a 3-week period, able to encapsulate more than 90% of loaded 5-FU. Nevertheless, they exhibited fast drug release (under 8h) with no pH-response, evidencing a non-specific mechanism. Therefore, strategies to introduce pH-responsive release were investigated. In order to preserve the liposomes stability at physiological conditions, a surface modification rather than the conventional method of composition alteration was preferred. Regarding this, an innovative coating procedure with Eudragit® family of polymers offered a promising alternative. Moreover, the broad range of Eudragit® formulations, providing opposite pH-responsive behaviours depending on the intended application, enabled the optimization of the coating process to obtain a versatile liposomal platform. Accordingly, two oppositely pH-responsive coatings (Eudragit® S100 and EPO) were implemented to evaluate drug release under contrasting conditions, thereby expanding the potential applicability of stable liposomes at physiological conditions for enhancing cancer therapy through different administration routes. Eudragit® S100 (EU S100, designed for alkaline releases) coating procedure provided liposomal micron scale aggregates due to its high molecular weight and behaviour in aqueous solution. Meanwhile, Eudragit® EPO (EU EPO, designed for acidic releases) showed stable liposomal systems slightly larger (114 nm) but still monodisperse (PDI <0.15), presenting a promising formulation for the thesis objective. Moreover, both coatings showed higher encapsulation efficiencies than the conventional liposomes, and their releases were delayed until 24 h, preventing up to 50% of drug release in insoluble pH ranges for each coating. Mathematical modelling supported that insoluble coatings introduced a change in release mechanism, whilst supporting diffusion as the predominant one in Higuchi and first order fittings. This presented potential applications for alkaline delivery in colon or intestine from oral formulations (EU S100), and more importantly, acidic tumour microenvironment targeting (EU EPO). In fact, cell viability studies showed biocompatibility of all developed liposomal formulations. The pH-response of both coatings was validated through MTT assays in healthy fibroblast (HS-5) and breast cancer (BT-474) cell lines. Specifically, EU EPO coated liposomes enhanced cytotoxicity over 30% more than the rest of formulations in breast cancer cells after 72h, preserving fibroblasts viability. Therefore, tumour targeting was confirmed by in vitro studies. In parallel, a thermo-responsive injectable PF-127 hydrogel platform was developed for the local drug delivery reservoir. Comprehensive rheological analyses were used to characterize the thermo-response and evaluate the gelation completion temperature, the viscoelasticity and viscosity of the system, and ultimately, the suitability for injection and sustained release. Since PF-127 hydrogel showed fast degradation, different polysaccharides were implemented in the hydrogel network and the effect of their concentrations as well as their structural conformations was studied. Implemented polysaccharides matrices presented improved rheological properties (G’ from 8 to 11-18 kPa) and more resistance against flow (viscosities from 4.1 to 6.1-7.1 Pa·s), establishing final optimal formulations for local administration. These formulations provided a more prolonged 5-FU release, reaching up to four times (450 min) the release time that PF-127 hydrogel exhibited (90 min). Moreover, mathematical modelling confirmed that the polysaccharides implementation caused an additional diffusional resistance based on their concentration and structural complexity, decreasing the degradation rate and resisting water permeation through the matrix. The final hybrid dual-responsive platform was synthesized by incorporating the pH-responsive Eudragit® EPO coated liposomes into the thermo-responsive injectable PF-127 hydrogel matrix. Characterization techniques showed the successful liposomal incorporation into the hydrogel matrix via scanning electron microscopy, as well as improved viscoelastic properties (G’ of 15 kPa, and viscosity of 6.8 Pa·s) of the system via rheology. Moreover, the pH-responsiveness was preserved, as demonstrated by drug release studies. In fact, hydrogel incorporation introduced an additional diffusion barrier, leading to a sustained 5-FU release for up to 48h, where up to 50% of drug release was prevented for coating insolubility range. This insolubility proved once again a change of release mechanism in one and two-stage models fitting, whilst the hydrogel matrix delayed release was supported by lower kinetic constants. Finally, biological validation of the dual-responsive system was performed in 2D cell cultures and 3D breast tumour spheroids, for a better prediction of its in vivo behaviour. 2D cell assays replicated the results shown in liposomal systems, with the only exception that tumour cell mortality was slightly reduced (from 5% cell viability to 15% in 3 days) for the dual-responsive formulation, which was attributed to the delayed 5-FU release. However, the tumour targeting capacity was preserved. This was further supported by the results obtained in 3D tumour spheroids assays, where the dual-responsive hydrogel targeted successfully cancer cells promoting its therapeutic efficiency, showing disaggregated and disintegrated spheroids compared to off-targeting drug solution (from 40% cell viability in 5-FU solution to 28% in dual-responsive hydrogel after 3 days). Overall, this thesis presents an engineered dual-responsive local drug delivery platform for post-surgical breast cancer treatment. The innovative strategy of combining two separately optimized stimuli-responses for local administration and tumour targeting presented improvements regarding the current therapies: High therapeutic efficiency, and decreased systemic toxicity.