Estudio funcional y metabolómico del gen bfr y de las posibles quinasas del regulador maestro Aor1 en la producción de antibióticos de Streptomyces coelicolor

Abstract

[ES] Debido a la crisis generada por las bacterias resistentes a antibióticos, es necesario identificar nuevas moléculas con potencial antibiótico que permitan tratar las infecciones bacterianas actuales. Uno de los abordajes para conseguir este objetivo es el estudio de la regulación de la producción de antibióticos por microorganismos productores. Entre ellos, las bacterias del género Streptomyces poseen un gran potencial, dada su gran cantidad de genes que permiten la síntesis de metabolitos secundarios. Estos genes están muy controlados por factores de regulación que integran señales externas e internas, de modo que caracterizar estas redes es crucial para comprender qué factores son necesarios para incrementar la producción de antibióticos y para despertar genes no activados en condiciones de laboratorio, que puedan ser claves para la producción de nuevas moléculas. En este trabajo, se ha profundizado en el estudio de las redes de regulación de S. coelicolor, organismo modelo del género Streptomyces. Los sistemas de dos componentes (TCS) en estas bacterias cumplen un papel esencial en el control del desarrollo y del metabolismo. Algunos TCS descritos en nuestro grupo de investigación intervienen en la producción de antibióticos en S. coelicolor, y todos ellos regulan el gen bfr, que codifica la bacterioferritina Bfr. Entre estos TCS destaca el regulador huérfano Aor1, que tiene gran influencia en la expresión del genoma de S. coelicolor y cuya histidina quinasa asociada, encargada de activarlo, se desconoce. En primer lugar, en esta tesis se describe el papel de la bacterioferritina codificada por el gen bfr en el desarrollo de S. coelicolor mediante el estudio del mutante de deleción Δbfr. Bfr es un elemento necesario para una correcta diferenciación y producción de antibióticos (actinorrodina, prodigiosinas y coelimicinas) en medios de cultivo complejos, mientras que en medio mínimo su efecto depende de la concentración de hierro y del estado (sólido o líquido) del medio. Bfr está implicada en la homeostasis del hierro, pero esta no es su función principal al no alterarse los niveles de hierro en el mutante Δbfr. La ausencia de bfr causa cambios a nivel proteómico: aumenta la abundancia de proteínas de estrés oxidativo (y los niveles de especies reactivas de oxígeno en el mutante), del antibiótico dependiente de calcio y de proteínas de respiración, mientras que disminuye la abundancia de proteínas de desarrollo, de varios clústeres para biosíntesis de metabolitos y de traducción. Además, varias proteínas de señalización alteran sus niveles en el mutante Δbfr. Con los datos de esta tesis, se propone un modelo en el que Bfr es necesaria para donar hierro a proteínas de regulación importantes para la síntesis de metabolitos secundarios. En cuanto al regulador huérfano Aor1, mediante varias estrategias, se han identificado varias quinasas que podrían estar asociadas a este regulador: SCO3750 (quinasa huérfana), SCO2215 (asociada al regulador SCO2216) y SCO2359 (asociada al regulador SCO2358). La asociación entre estas proteínas y Aor1 se ha estudiado mediante la generación de mutantes de deleción y CRISPR de interferencia, y se ha validado mediante ensayos de dos híbridos. También se ha estudiado brevemente la relación entre el sistema AbrC, previamente caracterizado en el laboratorio, con Aor1. Aún quedan por caracterizar las señales a las que responden estas proteínas y su mecanismo de regulación. Finalmente, se realizó un estudio metabolómico de varias cepas de interés relacionadas con los TCS estudiados en este trabajo: la cepa silvestre y los mutantes ΔabrA, Δbfr, Δaor1, ΔSCO3750, ΔSCO2359 y ΔSCO2359/2358. Muchos de los metabolitos anotados al comparar los metabolomas de cada mutante con el silvestre no se pudieron identificar con exactitud, lo cual refleja el conocimiento que falta en el metabolismo de S. coelicolor. La identificación de estos metabolitos sería clave para profundizar en los mecanismos de regulación de estos sistemas. En conclusión, esta tesis caracteriza en gran medida el papel de bfr en la red regulatoria de la producción de antibióticos de S. coelicolor, y profundiza en la red molecular del regulador huérfano Aor1 mediante su relación con nuevos elementos no descritos anteriormente (la quinasa huérfana SCO3750 y los TCS SCO2215/2216 y SCO2359/2358) y con el sistema AbrC. Además, este trabajo inicia el estudio metabolómico de estos sistemas involucrados en la síntesis de antibióticos y propone su estudio más detallado para comprender las redes de regulación de S. coelicolor y mejorar la producción y descubrimiento de metabolitos secundarios.

[EN] Due to the crisis caused by antibiotic-resistant bacteria, it is necessary to identify new molecules with antibiotic potential that can treat current bacterial infections. One approach to achieve this goal is to study the regulation of antibiotic production by antibiotic-producing microorganisms. Among these, bacteria from the genus Streptomyces have great potential, given their large number of genes that enable the synthesis of secondary metabolites. These genes are tightly controlled by regulatory factors that integrate external and internal signals, so characterizing these networks is crucial to understand which factors are necessary to increase antibiotic production and to turn on genes that are not activated under laboratory conditions, which may be key to the production of new molecules. In this work, we have delved deeper into the study of the regulatory networks of S. coelicolor, a model organism of the Streptomyces genus. Two-component systems (TCS) in these bacteria play an essential role in controlling development and metabolism. Some TCS described in our research group are involved in the production of antibiotics in S. coelicolor, and all of them regulate the bfr gene, which encodes the bacterioferritin Bfr. Among these TCS, the orphan regulator Aor1 stands out, which has a major influence on the expression of the genome of S. coelicolor and whose associated histidine kinase, responsible for activating it, is unknown. Firstly, this thesis describes the role of the bacterioferritin codified by the bfr gene in the development of S. coelicolor by studying the Δbfr deletion mutant. Bfr is a necessary element for the correct differentiation and production of antibiotics (actinorhodin, prodigiosins and coelimycins) in complex culture media, while in minimal media its effect depends on the iron concentration and the state (solid or liquid) of the medium. Bfr is involved in iron homeostasis, but this is not its main function, as iron levels are not altered in the Δbfr mutant. The lack of bfr produces changes at the proteomic level: the abundance of proteins linked to oxidative stress (and levels of reactive oxygen species in the mutant), calcium-dependent antibiotic and respiration proteins increases, while the abundance of developmental proteins, various clusters for metabolites biosynthesis and translation proteins decreases. In addition, several signaling proteins alter their levels in the Δbfr mutant. Based on the data from this thesis, a model is proposed in which Bfr is necessary to donate iron to regulatory proteins important for the synthesis of secondary metabolites. As for the orphan regulator Aor1, several strategies have been used to identify several kinases that could be associated with this regulator: SCO3750 (orphan kinase), SCO2215 (associated with the regulator SCO2216) and SCO2359 (associated with the regulator SCO2358). The association between these proteins and Aor1 has been studied by generating deletion mutants and CRISPR interference and has been validated by two-hybrid assays. The relationship between the AbrC system, previously characterized in the laboratory, and Aor1 has also been briefly studied. The signals these proteins respond to, and their regulatory mechanism, remain to be characterized. Finally, a metabolomic study was performed on several strains of interest related to the TCS studied in this work: the wild-type strain and the mutants ΔabrA, Δbfr, Δaor1, ΔSCO3750, ΔSCO2359 and ΔSCO2359/2358. Many of the metabolites noted when comparing the metabolomes of each mutant with the wild type could not be identified with certainty, reflecting the lack of knowledge about the metabolism of S. coelicolor. The identification of these metabolites would be key to further understanding the regulatory mechanisms of these systems. In conclusion, this thesis largely characterizes the role of bfr in the regulatory network of antibiotic production in S. coelicolor and delves into the molecular network of the orphan regulator Aor1 through its relationship with new, previously undescribed elements (the orphan kinase SCO3750 and the TCS SCO2215/2216 and SCO2359/2358) and with the AbrC system. Furthermore, this work initiates the metabolomic study of these systems involved in antibiotic synthesis and proposes more detailed studies to understand the regulatory networks of S. coelicolor and improve the production and discovery of secondary metabolites.