Aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen "Thpg1" de "Trichoderma harzianum"

Abstract

Muchas especies del género Trichoderma son utilizadas como agentes de control biológico en agricultura. En este sentido, se han propuesto varios mecanismos de acción como el micoparasitismo, la antibiosis y la competencia por el espacio. Parte de la actividad antagonista de este agente de biocontrol está basada en la secreción de enzimas, como quitinasas o glucanasas, que participan en la penetración del patógeno. Sin embargo, en los últimos años se está prestando una mayor atención a la relación entre Trichoderma y la planta y a aquellas enzimas que podrían iniciar el diálogo con ésta. Así se han propuesto distintos mecanismos de acción como la promoción del crecimiento de la planta o la inducción de respuestas de defensa. Éste último, es el caso de las endopoligalacturonasas fúngicas (endoPGs), enzimas que degradan la pectina, el principal constituyente de la pared celular vegetal. Pero a diferencia de lo que ocurre con los hongos patógenos, Trichoderma establece una relación simbiótica y avirulenta con la planta.En este sentido, se ha estudiado el papel que tiene el gen Thpg1, que codifica una endopoligalacturonasa de la cepa T. harzianum T34 en su relación con la planta. Dentro del proyecto de genómica funcional TrichoEST se identificó la EST 10663, obtenida tras cultivar la cepa T34 en presencia de polímeros de la pared vegetal, y que presentaba una alta homología en bases de datos con endoPGs fúngicas. En este trabajo se aisló y clonó el gen Thpg1y se caracterizó utilizando diferentes aproximaciones como el silenciamiento génico, la expresión en sistemas heterólogos (Arabidopsis thaliana), el uso de microarrays de A. thaliana o la proteómica.Los resultados aportados por todas estas técnicas han permitido relacionar el gen Thpg1 con la maceración del material vegetal y el tipo de vida saprofítica de Trichoderma ya que uno de los transformantes silenciados mostraba un menor crecimiento, que la cepa silvestre, en un medio suplementado con pectina como única fuente de carbono. En relación con la planta, tanto los resultados del estudio con microarrays, como las plantas transgénicas que expresan el gen Thpg1, relacionan este gen con la inducción de respuestas de defensa en la planta, a través de la producción de moléculas elicitoras como los oligogalacturónidos.

Most species of Trichoderma have been linked to biocontrol and biotechnological applications. Their antagonistic abilities are described as a combination of several mechanisms such as nutrient competition and direct mycoparasitism, producing antifungal metabolites and cell wall (CW) degrading enzymes such as glucanases or quitinases. However, the last studies about Trichoderma are aimed to analyze the Trichoderma-plant relationship and the enzymes which take part in that crosstalk. In this sense, it has been also described the capacity of this fungus to promote growth and induce resistance in plants.The endopolygalacturonases (endoPGs) hydrolyse the pectin which is a major component of plant cell wall. Those enzymes are produced during the fungal attack to the plant. Nevertheless, Trichoderma is a non pathogenic symbiotic fungus. In this sense, it has been analyse the role of Thpg1 gene, which codified and endoPG, in the T. harzianum-plant relationship. Within the framework of the EU-funded TrichoEST project, a functional genomics project, the EST 10663 was obtained when T. harzianum T34 was cultured in medium with plant material such as pectin or polygalacturonic acid. This EST showed high identity with fungus endoPGs. In this work we report the cloning and characterization of the Thpg1 gene in the biocontrol fungus T. harzianum T34. We also investigated the function of Thpg1 gene by expression of this gene in Arabidopsis thaliana plant, by gene silencing in T. harzianum T34 and by using A. thaliana microarrays and proteomic approach.All results showed that the Thpg1 gene is related with the saprophytic lifestyle of Trichoderma and the plant material hydrolysed. In this sense, a Thpg1 silenced transformant grew less than the wilt type, in a medium supplemented with pectin as unique carbon source. On the other hand, the microarrays results and transgenic plants showed a relationship between the Thpg1 gene and the capacity to generate a defence answer in the plant.