Nuevas aplicaciones de la electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas para la evaluación de metabolitos endógenos de interés clínico en orina

Abstract

[ES]Uno de los campos actuales dentro de la Química Analítica de aplicación clínica, es la puesta a punto de métodos de análisis rápidos y eficaces para la determinación de metabolitos endógenos de interés clínico en fluidos biológicos. En este contexto se sitúan los nucleósidos y nucleobases libres y modificados, compuestos que se excretan de forma natural en la orina como productos de la regeneración del ARN de trasferencia (ARNt) y de la reparación del ADN como resultado del daño por estrés oxidativo. Sus niveles en orina aumentan de forma anómala bajo ciertas patologías como procesos tumorales y enfermedades neurodegenerativas, de forma que estas sustancias son de gran interés en química clínica como biomarcadores. Se ha descrito la potencial utilidad de los nucleósidos libres y modificados como marcadores biológicos de enfermedades tan diversas como artritis reumatoide, Alzheimer o SIDA, y principalmente, como marcadores tempranos de muy diversos tipos de cáncer. Existen también estudios que relacionan los niveles en orina de nucleósidos modificados con otras enfermedades benignas y con diversos hábitos de vida, como tabaquismo, fatiga, estrés, mala alimentación, exposición a compuestos tóxicos, etc. Por ello, la mayoría de estos compuestos, de interés como marcadores biológicos, carecen de especificidad por lo que no pueden usarse como prueba única de diagnóstico; en cambio, si son de utilidad para el diagnóstico precoz de ciertas enfermedades, en el control de la eficacia de un tratamiento o una terapia específica y en el seguimiento de recurrencias postoperatorias. El objeto de este trabajo es el desarrollo de metodologías analíticas rápidas y eficaces que puedan ser aplicables a la separación, identificación y cuantificación de un amplio conjunto de nucleósidos libres y modificados en fluidos biológicos. Se elige la orina como matriz por ser una muestra de tipo no invasivo de fácil obtención. Como técnica de análisis se utilizará la electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas (CE-MS) que aúna las ventajas inherentes de la electroforesis capilar como técnica de separación de alta eficacia, con el poder de identificación de la detección mediante espectrometría de masas. Además la electroforesis capilar es muy apropiada para su aplicación en el análisis de muestras biológicas ya que es una técnica compatible con medios acuosos y adecuada para la separación de compuestos de gran polaridad, iónicos o ionizables, requisitos que se ajustan a la mayoría de los metabolitos encontrados en fluidos biológicos como la orina.

Para su aplicación a una matriz compleja como es la orina se requiere el desarrollo de procedimientos de extracción/limpieza/preconcentración con objeto de favorecer la detección y cuantificación de los analitos y de preservar el equipo instrumental. Se estudió la aplicación de una técnica de amplio uso como es la extracción en fase sólida (SPE) y, también, una modalidad menos frecuente basada en el uso de un material de acceso restringido (RAM) debido a la capacidad que presentan estos materiales para excluir las macromoléculas, gracias a un mecanismo de exclusión molecular.

Finalmente se pretende verificar la aplicabilidad de las metodologías desarrolladas en el análisis de muestras de orina de donantes sanos, fumadores y no fumadores. Este estudio tiene por objeto comprobar si el consumo de tabaco influye en los niveles de estos nucleósidos en orina, con respecto a los niveles de referencia de individuos sanos no fumadores. Así se podría determinar si el consumo de tabaco es un factor adicional en el contenido de estos nucleósidos en orina.

Por último, se realizará una búsqueda de nuevos metabolitos asociados al consumo de tabaco, adaptando los estudios desarrollados al campo de la metabolómica. Para ello se plantea un estudio no dirigido, utilizando un detector de espectrometría de masas de elevada exactitud y resolución, como el analizador de tiempo de vuelo (TOF) para el análisis de muestras de orina de fumadores y no fumadores.