Resumen de tesis.Mushrooms as a source of high-value bioactive molecules: conversion of ergosterol into vitamin D2, extraction, stabilisation, and a study using bakery products

Abstract

[ES] Son numerosos los factores que contribuyen a la existencia de riesgo de déficit de vitamina D en la población europea. Este déficit favorece una menor absorción de calcio y fosfato, lo que puede causar varios trastornos de salud graves. Los alimentos naturales (no enriquecidos), por sí mismos, rara vez proporcionan suficiente vitamina D para prevenir el déficit, por lo que alimentos enriquecidos con vitamina D y/o suplementos de vitamina D pueden ayudar a prevenir la carencia cuando la exposición al sol es inadecuada. Sin embargo, la mayoría de los suplementos disponibles utilizan vitamina D que proviene de fuentes sintéticas, por lo que disponer de vitamina D de una fuente natural sería una alternativa para superar los problemas que conlleva el uso de aditivos sintéticos y contribuiría a proporcionar beneficios para la salud. En este sentido, la industria alimentaria está constantemente buscando ingredientes de fuentes naturales debido a sus propiedades multifuncionales, eficacia competitiva y efectos de menor toxicidad. Los hongos han sido una parte esencial de nuestra dieta durante muchos años debido a su rico contenido nutricional y abundancia en biomoléculas, específicamente ergosterol, una provitamina D2. Sin embargo, es necesario llegar a un número más significativo de individuos, por lo que, a la hora de pensar en un grupo de alimentos candidatos a la fortificación, es necesario elegir una matriz alimentaria como los cereales, principalmente el trigo, consumida por un gran porcentaje de la población mundial, y cuya harina se utiliza para desarrollar muchos productos alimenticios en todo el mundo. A lo largo de esta tesis se han propuesto alternativas para solventar alguna de las cuestiones arriba planteadas. Así, con el objetivo de obtener vitamina D de una fuente natural (hongos - vitamina D2) ha sido necesario desarrollar varias metodologías, desde la producción de hongos hasta la obtención de vitamina D2. Después de obtener la vitamina D2 su estabilización también es esencial, por lo que se han desarrollado metodologías de encapsulación para asegurar que se mantienen sus propiedades cuando se incorpora al producto final. Por otra parte, asumiendo que la vitamina D es esencial para muchas funciones en el organismo, pero principalmente para los huesos, fue necesario validar el concepto de que la vitamina D2 promueve la absorción de calcio. El trabajo llevado a cabo en la presente Tesis doctoral muestra que es posible obtener y estabilizar la vitamina D2 natural de los hongos e incorporarla a una matriz de harina utilizando tecnologías innovadoras de extracción, irradiación y encapsulación. Por otra parte, con el fin de maximizar los compuestos bioactivos presentes en los hongos, se ha realizado un estudio para complementar los sustratos donde se cultivan los hongos con silicato de calcio. Esta suplementación se ha relacionado con una mayor resistencia contra las plagas de insectos. Sin embargo, pocos estudios muestran el impacto de esta suplementación en los diferentes parámetros agronómicos de los hongos de ostra (Pleurotus ostreatus var. florida) o incluso su composición química y bioactividad (actividades antioxidantes, antibacterianas y antifúngicas). Teniendo en cuenta el aumento de la producción y el consumo de hongos, el hecho de ser un alimento muy perecedero representa un inconveniente comercial significativo. Es necesario, por tanto, diseñar procesos de conservación que, además de aumentar la vida útil del producto, sean inofensivos para los consumidores. En este sentido, se evaluaron los efectos de la radiación gamma y de haz de electrones en la composición química y nutricional de muestras frescas y secas de Agaricus bisporus Portobello. Por otra parte, se evaluó la posibilidad de agregar valor a los biorresiduos sobrantes de la industria del cultivo de hongos. En esencia, las partes de hongos no utilizadas se sometieron a extracción e irradiación UV-C para aumentar el contenido de vitamina D2 y validar su extracción. La concentración de vitamina D2 en tres especies diferentes de hongos (Agaricus bisporus, A. bisporus Portobello y Pleurotus ostreatus) se obtuvo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando un detector ultravioleta (UV). Estos resultados son buenos indicadores de la viabilidad de los excedentes de setas industriales como fuentes alimentarias sostenibles de vitamina D2, y también ayudan a reforzar los principios de circularidad asociados a la cadena de producción de setas. Se continuaron los estudios con las mejores condiciones de irradiación y el hongo que presentó el mejor contenido de vitamina D2 (A. bisporus Portobello). En este sentido, el hongo Portobello se sometió a extracción (uso de metodologías más respetuosas con el medio ambiente (UAE) y disolventes (etanol)) para obtener el extracto rico en ergosterol, que luego se irradiaba para convertir el ergosterol en vitamina D2. Una vez optimizados los métodos de obtención de vitamina D2, se trabajó en el desarrollo de alimentos fortificados que abren la oportunidad de diseñar nuevos productos que no solo alimentan y nutren, sino que también proporcionan compuestos bioactivos necesarios para el buen funcionamiento del organismo, evitando la dependencia de la ingesta de fármacos o suplementos con contenidos sintéticos. En este contexto, la vitamina D2 es un candidato adecuado para ser ingerido de forma sencilla en la dieta diaria, concretamente utilizando como matriz el pan. Una de las estrategias para asegurar la protección de la bioactividad durante la producción de panes fortificados consiste en su encapsulación para ser incorporada en forma de partículas, facilitando una distribución homogénea en la masa de pan. En esta prueba de concepto, se realizaron estudios de estabilización donde se prepararon partículas que incluían contenidos de vitamina D2 utilizando polímeros, mediante tecnología de dispersión sólida. La caracterización cualitativa y cuantitativa de la encapsulación de vitamina D2 permitió corroborar la efectividad del proceso de dispersión de sólidos para todas las formulaciones. Además, la metodología permitió el desarrollo de una formulación final con el extracto enriquecido con VitD2 utilizando polímero de k-carragenina (KC-Bioactive) y la incorporación en los panes de cantidades específicas de vitamina D2, que posteriormente fueron identificadas y cuantificadas, validando la prueba de concepto de los panes fortificados desarrollados. Además, el extracto enriquecido en vitamina D2 más prometedor se sometió a una evaluación de prueba de concepto del aumento de la absorción de calcio por la línea celular ósea de osteoblastos (h-FOB 1.19) mediante un ensayo in vitro, confirmándose la hipótesis de partida. Para aumentar la confianza del consumidor europeo, y de los portugueses en particular, en los productos que compran y consumen diariamente, se estudiaron las propiedades físicas y químicas de siete tipos de harinas de trigo y centeno, así como la posible presencia de micotoxinas y microorganismos. Hasta donde sabemos, esta es la primera caracterización de harinas de trigo y centeno de origen portugués. Los estudios sobre harinas elaboradas a partir de subproductos de cereales las caracterizan como ingredientes sostenibles para el desarrollo de nuevos productos de panadería y alimentos funcionales y contribuyen a un mejor aprovechamiento de los recursos biológicos, la eficiencia y la circularidad. Los subproductos de cereales (germen de trigo, mezcla de salvado de maíz-germen, salvado de centeno y salvado de trigo) de la industria de molienda de harina se caracterizaron por su valor nutricional y composición química, así como por sus actividades antioxidantes y antibacterianas. Todas las harinas mencionadas anteriormente pueden servir como una matriz alimenticia fortificada con vitamina D2. Los productos finales (harina y pan) se desarrollaron utilizando una de las harinas mencionadas anteriormente (harina de trigo tipo 65). Se examinaron las características sensoriales de las muestras de harina y pan fortificadas con KC-Bioactive y forma libre extracto enriquecido con VitD2) y se comparó su rendimiento con las muestras no fortificadas (control). [EN] Many factors put Europe at risk of vitamin D deficiency. This deficiency causes the body to absorb less calcium and phosphate, and if there is not enough calcium and phosphate to keep the body healthy, it can cause several serious health disorders. Natural (unenriched) foods by themselves rarely provide sufficient vitamin D to prevent deficiency. Vitamin D-enriched foods and vitamin D supplements can help prevent deficiency when sun exposure is inadequate, but most of them are from synthetic sources. So, vitamin D from a natural source would be an alternative to overcome the problems of synthetic additives and help provide health benefits. The food industry is constantly searching for ingredients from natural sources due to their multifunctional properties, competitive efficacy, and lower toxicity effects, which can be used as a food fortifier. Mushrooms have been an essential part of our diet for many years due to their rich nutritional content and abundance in biomolecules, specifically ergosterol, a provitamin D2. However, reaching a more significant number of individuals is necessary. Consequently, it has been necessary to choose a food matrix consumed by a large proportion of the world's population, such as cereals, mainly wheat, whose flour is used to develop many food products worldwide. Further, to obtain vitamin D from a natural source (mushrooms - vitamin D2) is necessary to develop several methodologies, from producing mushrooms to obtaining vitamin D2. After obtaining vitamin D2, its stabilisation is also essential, so encapsulation methodologies are a choice to ensure the properties of vitamin D2 when incorporated into the final product. Vitamin D is essential for many functions in the body, but mainly for the bones, so validating the concept that vitamin D2 promotes calcium absorption is needed. The following description shows that it is possible to obtain and stabilise natural vitamin D2 from mushrooms and incorporate it into a flour matrix using innovative extraction, irradiation, and encapsulation technologies. As a result, in order to maximize the bioactive compounds, present in mushrooms, a study has been done to supplement mushroom substrates with calcium silicate. This supplementation has been linked to increased resistance against insect pests. However, few studies show the impact of this supplementation on the different agronomic parameters of oyster mushrooms (Pleurotus ostreatus var. florida) or even their chemical and bioactive composition (antioxidant, antibacterial and antifungal activities). Considering the increased production and consumption of mushrooms, the high perishability represents a significant commercial drawback. In addition to increasing the product's shelf life, preservation processes should be harmless to consumers. Therefore, the effects of gamma radiation and electron beam on the chemical and nutritional composition of fresh and dried samples of Agaricus bisporus Portobello was evaluated. A study illustrating the possibility of adding value to bioresidues left over from the mushroom cultivation industry was done. In essence, unused mushroom parts were subjected to extraction and UV-C irradiation to increase the vitamin D2 content and validate its extraction. The concentration of vitamin D2 in three different mushroom species (Agaricus bisporus, A. bisporus Portobello, and Pleurotus ostreatus) was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) using an ultraviolet (UV) detector. These results are good indicators of the viability of industrial mushroom surpluses as sustainable food sources of vitamin D2, and also help to reinforce the circularity principles associated with the mushroom production chain. Studies were continued with the best irradiation conditions and the mushroom that presented the best vitamin D2 content (A. bisporus Portobello). In this sense, the Portobello mushroom was subjected to extraction (use of more environmentally friendly methodologies (UAE) and solvents (ethanol)) to obtain the extract rich in ergosterol, which was then irradiated to convert the ergosterol into vitamin D2. New fortified foods open the opportunity to design new tailor-made products that not only feed and nourish but also provide bioactive compounds necessary for the proper functioning of the body, avoiding dependence on the intake of drugs or supplements with synthetic contents. In this context, vitamin D2 is a suitable candidate to be ingested in a simple way in the daily diet, namely in bread. One of the strategies to ensure the protection of bioactivity during the production of fortified bread involves its encapsulation to be incorporated in the form of particles, facilitating a homogeneous distribution in the bread dough. In this proof of concept, stabilization studies were performed where particles containing vitamin D2 contents were prepared using polymers, through solid dispersion technology. The qualitative and quantitative characterization of vitamin D2 encapsulation allowed corroborating the effectiveness of the solid dispersion process for all formulations. Moreover, the methodology allowed the development of a final formulation with the VitD2-enriched extract using k-carrageenan polymer (KC-Bioactive) and the incorporation in the bread of specific amounts of vitamin D2, which were subsequently identified and quantified, validating the proof of concept of the developed fortified bread. Furthermore, the promising extract (UAE) was subjected to proof-of-concept evaluation of increased calcium absorption by osteoblast bone cell line (h-FOB 1.19) by in vitro assay. The results indicated that the VitD2-enriched extract increased calcium absorption by h-FOB 1.19 cell lines. Finally, seven types of wheat and rye flour were studied for their physical and chemical properties as well as the presence of mycotoxins and microorganisms. In this sense, increasing the confidence of the European consumer, and the Portuguese in particular, in the products they buy and consume daily. To our knowledge, this is the first characterization of wheat and rye flour for Portuguese consumers. Studies on flour made from cereal by-products characterize them as sustainable ingredients for developing new bakery products and functional foods and contribute to better use of biological resources, efficiency, and circularity. Cereal by-products (wheat germ, corn bran-germ blend, rye bran, and wheat bran) from the flour milling industry were characterised for their nutritional value and chemical composition, as well as antioxidant and antibacterial activities. All the flour mentioned above can serve as a food matrix fortified with vitamin D2. The final products (flour and bread) were developed using one of the flours mentioned above (wheat flour type 65). The sensory evaluation of the samples was examined by comparing the performance of flour and bread samples fortified with KC-Bioactive and free form (VitD2-enriched extract) with the unfortified (control) samples.